Спасибо, что посетили Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Генные векторы для лечения муковисцидоза легких должны быть нацелены на проводящие дыхательные пути, поскольку трансдукция периферических легких не имеет терапевтического эффекта.Эффективность вирусной трансдукции напрямую связана со временем пребывания носителя.Однако жидкости для доставки, такие как носители генов, естественным образом диффундируют в альвеолы ​​во время ингаляции, а терапевтические частицы любой формы быстро удаляются мукоцилиарным транспортом.Увеличение времени пребывания носителей генов в дыхательных путях важно, но труднодостижимо.Конъюгированные с носителем магнитные частицы, которые могут быть направлены на поверхность дыхательных путей, могут улучшить региональное нацеливание.Из-за проблем с визуализацией in vivo поведение таких маленьких магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля плохо изучено.Целью данного исследования было использование синхротронной визуализации для визуализации in vivo движения серии магнитных частиц в трахее анестезированных крыс с целью изучения динамики и закономерностей поведения одиночных и объемных частиц in vivo.Затем мы также оценили, повысит ли доставка лентивирусных магнитных частиц в присутствии магнитного поля эффективность трансдукции в трахее крысы.Синхротронное рентгеновское изображение показывает поведение магнитных частиц в стационарных и движущихся магнитных полях in vitro и in vivo.Частицы нельзя легко протащить по поверхности живых дыхательных путей с помощью магнитов, но во время транспортировки отложения концентрируются в поле зрения, где магнитное поле наиболее сильное.Эффективность трансдукции также увеличивалась в шесть раз, когда лентивирусные магнитные частицы доставлялись в присутствии магнитного поля.Взятые вместе, эти результаты показывают, что лентивирусные магнитные частицы и магнитные поля могут быть ценными подходами для улучшения нацеливания генных векторов и уровней трансдукции в проводящих дыхательных путях in vivo.
Кистозный фиброз (CF) вызывается вариациями в одном гене, называемом регулятором трансмембранной проводимости CF (CFTR).Белок CFTR представляет собой ионный канал, который присутствует во многих эпителиальных клетках по всему телу, включая дыхательные пути, основной участок патогенеза муковисцидоза.Дефекты CFTR приводят к аномальному транспорту воды, обезвоживанию поверхности дыхательных путей и уменьшению глубины поверхностного слоя жидкости (ASL) дыхательных путей.Это также ухудшает способность системы мукоцилиарного транспорта (MCT) очищать дыхательные пути от вдыхаемых частиц и патогенов.Наша цель — разработать лентивирусную (LV) генную терапию для доставки правильной копии гена CFTR и улучшения ASL, MCT и здоровья легких, а также продолжить разработку новых технологий, которые могут измерять эти параметры in vivo1.
Векторы LV являются одними из ведущих кандидатов для генной терапии муковисцидоза, главным образом потому, что они могут постоянно интегрировать терапевтический ген в базальные клетки дыхательных путей (стволовые клетки дыхательных путей).Это важно, потому что они могут восстановить нормальную гидратацию и очищение от слизи путем дифференцировки в функциональные скорректированные генами клетки поверхности дыхательных путей, связанные с кистозным фиброзом, что приводит к пожизненным преимуществам.Векторы ЛЖ должны быть направлены против проводящих дыхательных путей, так как именно здесь начинается поражение легких при муковисцидозе.Доставка вектора глубже в легкое может привести к альвеолярной трансдукции, но это не оказывает терапевтического эффекта при муковисцидозе.Однако жидкости, такие как носители генов, естественным образом мигрируют в альвеолы ​​при вдыхании после родов3,4, а терапевтические частицы быстро выбрасываются в полость рта МСТ.Эффективность трансдукции ЛЖ напрямую связана с продолжительностью времени, в течение которого вектор остается близко к клеткам-мишеням, чтобы обеспечить клеточное поглощение — «время пребывания» 5, которое легко сокращается за счет типичного регионарного воздушного потока, а также скоординированного поглощения слизи и частиц МСТ.При муковисцидозе способность продлевать время пребывания ЛЖ в дыхательных путях важна для достижения высокого уровня трансдукции в этой области, но до сих пор это было проблематично.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы предлагаем, чтобы магнитные частицы (MP) LV могли помочь двумя взаимодополняющими способами.Во-первых, они могут направляться магнитом к поверхности дыхательных путей, чтобы улучшить нацеливание и помочь частицам-носителям генов оказаться в нужной области дыхательных путей;и ASL) перемещаются в клеточный слой 6. MP широко используются в качестве целевых средств доставки лекарств, когда они связываются с антителами, химиотерапевтическими препаратами или другими небольшими молекулами, которые прикрепляются к клеточным мембранам или связываются с соответствующими рецепторами клеточной поверхности и накапливаются в опухолевых участках в наличие статического электричества.Магнитные поля для лечения рака 7. Другие «гипертермические» методы направлены на уничтожение опухолевых клеток путем нагревания МЧ при воздействии осциллирующих магнитных полей.Принцип магнитной трансфекции, при котором магнитное поле используется в качестве трансфекционного агента для усиления переноса ДНК в клетки, обычно используется in vitro с использованием ряда невирусных и вирусных генных векторов для трудно трансдуцируемых клеточных линий. ..Установлена ​​эффективность магнитотрансфекции ЛЖ с доставкой МЧ ЛЖ in vitro в клеточную линию бронхиального эпителия человека в присутствии постоянного магнитного поля, повышающая эффективность трансдукции в 186 раз по сравнению с вектором ЛЖ отдельно.МТ ЛЖ также применяли к модели муковисцидоза in vitro, где магнитная трансфекция увеличивала трансдукцию ЛЖ в культурах на границе раздела воздух-жидкость в 20 раз при наличии муковисцидоза в мокроте10.Однако магнитотрансфекции органов in vivo уделялось относительно мало внимания, и ее оценивали только в нескольких исследованиях на животных11,12,13,14,15, особенно в легких16,17.Однако возможности магнитной трансфекции в терапии легких при муковисцидозе очевидны.Тан и др.(2020) заявили, что «проверочное исследование по эффективной доставке магнитных наночастиц в легкие проложит путь к будущим стратегиям ингаляции CFTR для улучшения клинических результатов у пациентов с муковисцидозом»6.
Поведение мелких магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля трудно визуализировать и изучить, поэтому они мало изучены.В других исследованиях мы разработали метод фазово-контрастной визуализации на основе синхротронного распространения (PB-PCXI) для неинвазивной визуализации и количественной оценки мельчайших изменений in vivo в глубине ASL18 и поведении MCT19,20 для непосредственного измерения гидратации поверхности газового канала. и используется как ранний показатель эффективности лечения.Кроме того, в нашем методе оценки MCT используются частицы диаметром 10–35 мкм, состоящие из оксида алюминия или стекла с высоким коэффициентом преломления, в качестве маркеров MCT, видимых с помощью PB-PCXI21.Оба метода подходят для визуализации ряда типов частиц, включая MP.
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению наши анализы ASL и MCT на основе PB-PCXI хорошо подходят для изучения динамики и моделей поведения одиночных и объемных частиц in vivo, чтобы помочь нам понять и оптимизировать методы доставки генов MP.Подход, который мы используем здесь, основан на наших исследованиях с использованием линии луча SPring-8 BL20B2, в которых мы визуализировали движение жидкости после доставки дозы фиктивного вектора в носовые и легочные дыхательные пути мышей, чтобы помочь объяснить наблюдаемые нами гетерогенные паттерны экспрессии генов. в нашем ген.исследования на животных с дозой носителя 3,4.
Целью данного исследования было использование синхротрона PB-PCXI для визуализации in vivo движений серии МЧ в трахее живых крыс.Эти исследования изображений PB-PCXI были разработаны для проверки серии MP, силы магнитного поля и местоположения, чтобы определить их влияние на движение MP.Мы предполагали, что внешнее магнитное поле поможет доставленному МП удержаться или переместиться в район цели.Эти исследования также позволили нам определить конфигурации магнита, которые максимизируют количество частиц, оставшихся в трахее после осаждения.Во второй серии исследований мы стремились использовать эту оптимальную конфигурацию, чтобы продемонстрировать паттерн трансдукции, возникающий в результате доставки LV-MPs в дыхательные пути крыс in vivo, исходя из предположения, что доставка LV-MPs в контексте нацеливания на дыхательные пути приведет к в повышении эффективности трансдукции ЛЖ..
Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Университетом Аделаиды (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетом по этике животных SPring-8 Synchrotron.Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Все рентгеновские изображения были получены на линии луча BL20XU на синхротроне SPring-8 в Японии с использованием установки, аналогичной описанной ранее21,22.Вкратце, экспериментальный бокс располагался в 245 м от синхротронного накопителя.Расстояние от образца до детектора 0,6 м используется для исследований изображений частиц и 0,3 м для исследований изображений in vivo для создания эффектов фазового контраста.Использовался монохроматический пучок с энергией 25 кэВ.Изображения были получены с использованием рентгеновского преобразователя высокого разрешения (SPring-8 BM3), соединенного с детектором sCMOS.Преобразователь преобразует рентгеновские лучи в видимый свет с помощью сцинтиллятора толщиной 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), который затем направляется на датчик sCMOS с помощью объектива микроскопа ×10 (NA 0,3).Детектор sCMOS представлял собой Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размером матрицы 2048 × 2048 пикселей и размером необработанных пикселей 6,5 × 6,5 мкм.Эта настройка дает эффективный изотропный размер пикселя 0,51 мкм и поле зрения примерно 1,1 мм × 1,1 мм.Продолжительность воздействия 100 мс была выбрана для максимального соотношения сигнал-шум магнитных частиц внутри и снаружи дыхательных путей при минимизации артефактов движения, вызванных дыханием.Для исследований in vivo на пути рентгеновского излучения помещали быстродействующий рентгеновский затвор, чтобы ограничить дозу облучения путем блокировки рентгеновского луча между экспозициями.
Среда LV не использовалась ни в каких исследованиях визуализации SPring-8 PB-PCXI, поскольку камера визуализации BL20XU не сертифицирована на уровень биобезопасности 2.Вместо этого мы выбрали ряд хорошо охарактеризованных МП от двух коммерческих поставщиков, охватывающих диапазон размеров, материалов, концентраций железа и областей применения — сначала для того, чтобы понять, как магнитные поля влияют на движение МП в стеклянных капиллярах, а затем в живые дыхательные пути.поверхность.Размер МЧ варьируется от 0,25 до 18 мкм и изготавливается из различных материалов (см. табл. 1), но состав каждого образца, в том числе размер магнитных частиц в МЧ, неизвестен.Основываясь на наших обширных исследованиях MCT 19, 20, 21, 23, 24, мы ожидаем, что MP размером до 5 мкм можно увидеть на поверхности дыхательных путей трахеи, например, путем вычитания последовательных кадров, чтобы увидеть улучшенную видимость движения MP.Один MP 0,25 мкм меньше, чем разрешение устройства визуализации, но ожидается, что PB-PCXI обнаружит их объемный контраст и движение поверхностной жидкости, на которой они осаждаются после осаждения.
Образцы для каждого МП в таблице.1 готовили в стеклянных капиллярах объемом 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, USA) с внутренним диаметром 0,63 мм.Корпускулярные частицы доступны в воде, а частицы CombiMag доступны в запатентованной производителем жидкости.Каждая пробирка наполовину заполняется жидкостью (примерно 11 мкл) и помещается на держатель образца (см. рис. 1).Стеклянные капилляры располагались горизонтально на предметном столике в камере визуализации соответственно и располагались по краям жидкости.Магнит с никелевой оболочкой диаметром 19 мм (длиной 28 мм) из редкоземельных элементов, неодима, железа и бора (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остаточной намагниченностью 1,17 Тл был прикреплен к отдельная таблица передачи для достижения удаленного изменения вашей позиции во время рендеринга.Рентгеновское изображение начинается, когда магнит располагается примерно на 30 мм над образцом, и изображения получаются со скоростью 4 кадра в секунду.Во время визуализации магнит приближали к стеклянной капиллярной трубке (на расстоянии около 1 мм), а затем перемещали вдоль трубки для оценки влияния напряженности поля и положения.
Установка визуализации in vitro, содержащая образцы МП в стеклянных капиллярах на этапе трансляции образца xy.Путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией.
Как только была установлена ​​видимость MP in vitro, их подмножество было протестировано in vivo на самках белых крыс Wistar дикого типа (возраст ~ 12 недель, ~ 200 г).Медетомидин 0,24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Япония), мидазолам 3,2 мг/кг (Дормикум®, Астеллас Фарма, Япония) и буторфанол 4 мг/кг (Веторфале®, Мейдзи Сейка).Крыс анестезировали смесью Pharma (Япония) путем внутрибрюшинной инъекции.После анестезии они были подготовлены к визуализации путем удаления меха вокруг трахеи, введения эндотрахеальной трубки (ET; внутривенная канюля 16 Ga, Terumo BCT) и иммобилизации в положении лежа на специально изготовленной пластине для визуализации, содержащей термомешок. для поддержания температуры тела.22. Затем пластина для визуализации была прикреплена к предметному столику для образца в боксе для визуализации под небольшим углом, чтобы выровнять трахею по горизонтали на рентгеновском изображении, как показано на рис. 2а.
( а ) Установка визуализации in vivo в блоке визуализации SPring-8, путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией.(b,c) Локализация трахеального магнита выполнялась дистанционно с использованием двух ортогонально установленных IP-камер.В левой части изображения на экране вы можете видеть проволочную петлю, удерживающую головку, и доставочную канюлю, установленную внутри ЭТ-трубки.
Система шприцевого насоса с дистанционным управлением (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) с использованием стеклянного шприца на 100 мкл была соединена с трубкой PE10 (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) с помощью иглы 30 Ga.Пометьте трубку, чтобы убедиться, что кончик находится в правильном положении в трахее при введении эндотрахеальной трубки.С помощью микронасоса поршень шприца удаляли, а конец трубки погружали в образец МП, который необходимо доставить.Затем загруженную трубку для доставки вставили в эндотрахеальную трубку, поместив кончик в самую сильную часть нашего ожидаемого приложенного магнитного поля.Получение изображения контролировалось с помощью детектора дыхания, подключенного к нашему блоку синхронизации на базе Arduino, и все сигналы (например, температура, дыхание, открытие/закрытие затвора и получение изображения) записывались с помощью Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия). 22 При визуализации Когда корпус был недоступен, две IP-камеры (Panasonic BB-SC382) располагались примерно под углом 90° друг к другу и использовались для контроля положения магнита относительно трахеи во время визуализации (рис. 2b, c).Чтобы свести к минимуму артефакты движения, во время конечного плато дыхательного потока было получено одно изображение на вдох.
Магнит прикреплен ко второму столику, который может быть расположен удаленно снаружи корпуса формирователя изображения.Были протестированы различные положения и конфигурации магнита, включая: размещение под углом примерно 30° над трахеей (конфигурации показаны на рисунках 2а и 3а);один магнит над животным, а другой ниже, с полюсами, установленными для притяжения (рис. 3b)., один магнит над животным и один ниже, с полюсами, установленными для отталкивания (рис. 3c), и один магнит выше и перпендикулярно трахее (рис. 3d).После настройки животного и магнита и загрузки тестируемого MP в шприцевой насос доставьте дозу 50 мкл со скоростью 4 мкл/сек при получении изображений.Затем магнит перемещают вперед и назад вдоль или поперек трахеи, продолжая получать изображения.
Конфигурация магнита для визуализации in vivo (а) один магнит над трахеей под углом приблизительно 30°, (б) два магнита, сконфигурированные для притяжения, (в) два магнита, сконфигурированные для отталкивания, (г) один магнит над и перпендикулярно трахея.Наблюдатель смотрел вниз от рта к легким через трахею, и луч рентгеновского излучения проходил через левую сторону крысы и выходил из правой стороны.Магнит либо перемещают по длине дыхательных путей, либо влево и вправо над трахеей в направлении рентгеновского луча.
Мы также стремились определить видимость и поведение частиц в дыхательных путях при отсутствии смешения дыхания и частоты сердечных сокращений.Поэтому в конце периода визуализации животных гуманно усыпили из-за передозировки пентобарбитала (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, США; ~ 65 мг/кг внутрибрюшинно).Некоторых животных оставляли на платформе для визуализации, и после прекращения дыхания и сердцебиения процесс визуализации повторяли, добавляя дополнительную дозу МП, если на поверхности дыхательных путей не было видно МП.
Полученные изображения были скорректированы на плоское и темное поле, а затем собраны в фильм (20 кадров в секунду; 15–25 × нормальная скорость в зависимости от частоты дыхания) с использованием пользовательского сценария, написанного в MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Все исследования по доставке генного вектора LV проводились в Центре лабораторных исследований животных Университета Аделаиды и были направлены на использование результатов эксперимента SPring-8 для оценки того, может ли доставка LV-MP в присутствии магнитного поля усиливать перенос генов in vivo. .Для оценки эффектов МП и магнитного поля лечили две группы животных: одной группе вводили МП ЛЖ с размещением магнита, а другой группе вводили контрольную группу МП ЛЖ без магнита.
Векторы гена LV были созданы с использованием ранее описанных методов 25, 26 .Вектор LacZ экспрессирует локализованный в ядре ген бета-галактозидазы, управляемый конститутивным промотором MPSV (LV-LacZ), который продуцирует синий продукт реакции в трансдуцированных клетках, видимый на фронтах и ​​срезах легочной ткани.Титрование проводили в клеточных культурах путем ручного подсчета количества LacZ-положительных клеток с использованием гемоцитометра для расчета титра в ТЕ/мл.Носители криоконсервируют при -80°C, оттаивают перед использованием и связывают с CombiMag путем смешивания 1:1 и инкубируют на льду не менее 30 минут перед доставкой.
Нормальные крысы Sprague Dawley (n = 3/группа, ~2-3 анестезированных внутрибрюшинно смесью 0,4 мг/кг медетомидина (Domitor, Ilium, Австралия) и 60 мг/кг кетамина (Ilium, Австралия) в возрасте 1 месяца) внутрибрюшинно ) инъекция и нехирургическая пероральная канюляция с помощью внутривенной канюли 16 Ga.Чтобы гарантировать, что ткань дыхательных путей трахеи получает трансдукцию ЛЖ, ее кондиционировали с использованием нашего ранее описанного протокола механического возмущения, в котором поверхность дыхательных путей трахеи растирали в осевом направлении с помощью проволочной корзины (N-Circle, нитиноловый экстрактор камней без наконечника NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, США) 30 стр. 28.Затем, примерно через 10 минут после возмущения в боксе биобезопасности, производили трахеальное введение ЛВ-МП.
Магнитное поле, используемое в этом эксперименте, было сконфигурировано аналогично рентгеновскому исследованию in vivo, с теми же магнитами, удерживаемыми над трахеей с помощью зажимов для дистилляционных стентов (рис. 4).Объем 50 мкл (аликвоты 2 x 25 мкл) LV-MP доставляли в трахею (n = 3 животных) с помощью пипетки с гелевым наконечником, как описано ранее.Контрольная группа (n = 3 животных) получала тот же ЛВ-МП без применения магнита.После завершения инфузии канюлю удаляют из эндотрахеальной трубки и животное экстубируют.Магнит остается на месте в течение 10 минут, после чего его удаляют.Крысам подкожно вводили мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австралия) с последующей отменой анестезии путем внутрибрюшинной инъекции 1 мг/кг гидрохлорида атипамазола (Antisedan, Zoetis, Австралия).Крыс содержали в тепле и наблюдали до полного выхода из наркоза.
Устройство доставки ЛВ-МП в боксе биологической безопасности.Вы можете видеть, что светло-серая втулка Люэр-лока ЭТ-трубки выступает изо рта, а наконечник гелевой пипетки, показанный на рисунке, вводится через ЭТ-трубку на нужную глубину в трахею.
Через одну неделю после процедуры введения LV-MP животных гуманно умерщвляли путем ингаляции 100% CO2 и оценивали экспрессию LacZ с использованием нашего стандартного лечения X-gal.Три наиболее каудальных кольца хряща были удалены, чтобы гарантировать, что любое механическое повреждение или задержка жидкости из-за установки эндотрахеальной трубки не будут включены в анализ.Каждую трахею разрезали вдоль, чтобы получить две половинки для анализа, и помещали в чашку, содержащую силиконовый каучук (Sylgard, Dow Inc), с помощью иглы Minutien (Fine Science Tools) для визуализации поверхности просвета.Распределение и характер трансдуцированных клеток подтверждали фронтальной фотографией с использованием микроскопа Nikon (SMZ1500) с камерой DigiLite и программным обеспечением TCapture (Tucsen Photonics, Китай).Изображения были получены с 20-кратным увеличением (включая максимальную настройку для полной ширины трахеи), при этом вся длина трахеи отображалась шаг за шагом, обеспечивая достаточное перекрытие между каждым изображением, чтобы можно было «сшивать» изображения.Затем изображения из каждой трахеи были объединены в одно составное изображение с использованием редактора составных изображений версии 2.0.3 (Microsoft Research) с использованием алгоритма плоскостного движения. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 < оттенок < 0,58, насыщенность > 0,15 и значение < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составе изображений трахеи от каждого животного была определена с использованием адаптивного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как определено заранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Площадь экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с настройками 0,35.0,15 и значение <0,7.如 前所 述 使用 自动 自动 Matlab 脚本 (R2020A ， MathWorks） 对 每 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 的 表达 进行 进行 量化 ， 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7如 前所 述 自动 自动 自动 Matlab （(（r2020a ， Mathworks） 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 .................... БЕДРО Области экспрессии LacZ на составных изображениях трассеи каждой конкретной оценки определяют с использованием сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как предварительно, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7.Отслеживая контуры ткани в GIMP v2.10.24, для каждого составного изображения вручную создавалась маска, чтобы идентифицировать область ткани и предотвратить любые ложные обнаружения за пределами ткани трахеи.Окрашенные площади всех составных изображений от каждого животного суммировали, чтобы получить общую окрашенную площадь для этого животного.Затем окрашенная площадь была разделена на общую площадь маски для получения нормализованной площади.
Каждую трахею заливали парафином и делали срезы толщиной 5 мкм.Срезы контрастно окрашивали нейтральным быстрым красным в течение 5 минут, и изображения получали с использованием микроскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 и программного обеспечения для захвата элементов NIS (версия 5.20.00).
Все статистические анализы были выполнены в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статистическая значимость была установлена ​​на уровне p ≤ 0,05.Нормальность проверяли с помощью теста Шапиро-Уилка, а различия в окрашивании LacZ оценивали с помощью непарного t-критерия.
Шесть MP, описанных в таблице 1, были исследованы с помощью PCXI, а видимость описана в таблице 2. Два MP из полистирола (MP1 и MP2; 18 мкм и 0,25 мкм соответственно) не были видны с помощью PCXI, но остальные образцы можно было идентифицировать. (примеры показаны на рисунке 5).МП3 и МП4 видны слабо (10-15% Fe3O4; 0,25 мкм и 0,9 мкм соответственно).Хотя MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) содержал одни из самых мелких протестированных частиц, он был наиболее выраженным.Продукт CombiMag MP6 трудно отличить.Во всех случаях наша способность обнаруживать МП значительно улучшилась за счет перемещения магнита вперед и назад параллельно капилляру.По мере того, как магниты удалялись от капилляра, частицы вытягивались длинными цепочками, но по мере приближения магнитов и увеличения напряженности магнитного поля цепочки частиц сокращались, поскольку частицы мигрировали к верхней поверхности капилляра (см. Дополнительное видео S1). : MP4), увеличивая плотность частиц на поверхности.И наоборот, когда магнит удаляется из капилляра, напряженность поля уменьшается, и МП перестраиваются в длинные цепочки, отходящие от верхней поверхности капилляра (см. Дополнительное видео S2: MP4).После прекращения движения магнита частицы еще некоторое время продолжают двигаться после достижения положения равновесия.По мере того, как МП движется к верхней поверхности капилляра и от нее, магнитные частицы имеют тенденцию протягивать мусор через жидкость.
Видимость MP под PCXI значительно различается между образцами.(а) МР3, (б) МР4, (в) МР5 и (г) МР6.Все изображения, показанные здесь, были сделаны с магнитом, расположенным примерно на 10 мм непосредственно над капилляром.Кажущиеся большие круги представляют собой пузырьки воздуха, попавшие в капилляры, четко показывающие черно-белые краевые особенности фазово-контрастного изображения.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Обратите внимание, что диаметры магнитопроводов на всех рисунках даны не в масштабе и примерно в 100 раз больше, чем показано.
По мере того как магнит перемещается влево и вправо вдоль верхней части капилляра, угол струны МП изменяется, чтобы выровняться с магнитом (см. рис. 6), очерчивая таким образом линии магнитного поля.Для МП3-5 после достижения хордой порогового угла частицы тянутся по верхней поверхности капилляра.Это часто приводит к тому, что MP объединяются в более крупные группы рядом с самым сильным магнитным полем (см. Дополнительное видео S3: MP5).Это также особенно очевидно при визуализации близко к концу капилляра, что заставляет MP агрегировать и концентрироваться на границе раздела жидкость-воздух.Частицы в MP6, которые было труднее различить, чем частицы в MP3-5, не тянулись, когда магнит двигался вдоль капилляра, но струны MP диссоциировали, оставляя частицы в поле зрения (см. Дополнительное видео S4: MP6).В некоторых случаях, когда приложенное магнитное поле было уменьшено путем перемещения магнита на большое расстояние от места визуализации, любые оставшиеся МП медленно опускались на нижнюю поверхность трубки под действием силы тяжести, оставаясь в струне (см. Дополнительное видео S5: MP3) .
Угол струны МП изменяется по мере движения магнита вправо над капилляром.(а) МР3, (б) МР4, (в) МР5 и (г) МР6.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Обратите внимание, что дополнительные видеоролики предназначены для информационных целей, поскольку они раскрывают важную структуру частиц и динамическую информацию, которую нельзя визуализировать на этих статических изображениях.
Наши тесты показали, что медленное перемещение магнита вперед и назад вдоль трахеи облегчает визуализацию MF в контексте сложного движения in vivo.Тесты in vivo не проводились, поскольку гранулы полистирола (МР1 и МР2) не были видны в капилляре.Каждое из оставшихся четырех МП тестировалось in vivo с расположением длинной оси магнита над трахеей под углом примерно 30° к вертикали (см. рис. 2б и 3а), так как это приводило к более длинным цепочкам МП и было более эффективным. чем магнит..конфигурация прекращена.MP3, MP4 и MP6 не были обнаружены в трахее каких-либо живых животных.При визуализации дыхательных путей крыс после гуманного умерщвления животных частицы оставались невидимыми даже при добавлении дополнительного объема с помощью шприцевого насоса.MP5 имел самое высокое содержание оксида железа и был единственной видимой частицей, поэтому его использовали для оценки и характеристики поведения MP in vivo.
Размещение магнита над трахеей во время введения МФ приводило к тому, что многие, но не все, МФ концентрировались в поле зрения.Попадание частиц в трахею лучше всего наблюдается у гуманно умерщвленных животных.Рисунок 7 и дополнительное видео S6: MP5 показывает быстрый магнитный захват и выравнивание частиц на поверхности вентральной трахеи, что указывает на то, что MP могут быть нацелены на нужные области трахеи.При поиске более дистально по ходу трахеи после доставки МФ некоторые МФ были обнаружены ближе к килю, что свидетельствует о недостаточной напряженности магнитного поля для сбора и удержания всех МФ, поскольку они доставлялись через область максимальной напряженности магнитного поля при введении жидкости.процесс.Однако постнатальные концентрации МП были выше вокруг области изображения, что позволяет предположить, что многие МП оставались в областях дыхательных путей, где напряженность приложенного магнитного поля была самой высокой.
Изображения (а) до и (б) после доставки MP5 в трахею недавно подвергнутой эвтаназии крысы с помощью магнита, помещенного непосредственно над областью визуализации.Изображенный участок расположен между двумя хрящевыми кольцами.Перед введением МИ в дыхательных путях имеется некоторое количество жидкости.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Эти изображения взяты из видео, показанного в S6: MP5 Supplementary Video.
Перемещение магнита вдоль трахеи in vivo привело к изменению угла цепи MP на поверхности дыхательных путей, аналогично тому, что наблюдается в капиллярах (см. Рисунок 8 и дополнительное видео S7: MP5).Однако в нашем исследовании МЧ не могли волочиться по поверхности живых дыхательных путей, как это могли делать капилляры.В некоторых случаях цепочка МП удлиняется при движении магнита влево и вправо.Интересно, что мы также обнаружили, что цепочка частиц изменяет глубину поверхностного слоя жидкости при продольном перемещении магнита вдоль трахеи и расширяется при перемещении магнита прямо над головой и повороте цепочки частиц в вертикальное положение (см. Дополнительное видео S7).: MP5 в 0:09, внизу справа).Характерный паттерн движения менялся, когда магнит двигался латерально через верхнюю часть трахеи (т. е. влево или вправо от животного, а не по длине трахеи).Частицы все еще были хорошо видны во время их движения, но когда магнит был удален из трахеи, стали видны кончики струн частиц (см. Дополнительное видео S8: MP5, начиная с 0:08).Это согласуется с наблюдаемым поведением магнитного поля под действием приложенного магнитного поля в стеклянном капилляре.
Образцы изображений, показывающие MP5 в трахее живой анестезированной крысы.(а) Магнит используется для получения изображений выше и слева от трахеи, затем (б) после перемещения магнита вправо.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Эти изображения взяты из видео, представленного в S7 Supplementary Video: MP5.
Когда два полюса были настроены в направлении север-юг выше и ниже трахеи (т. е. притягивая; рис. 3б), хорды МП оказались длиннее и располагались на латеральной стенке трахеи, а не на дорсальной поверхности трахеи. трахея (см. Приложение).Видео S9:MP5).Однако высокие концентрации частиц в одном месте (т. е. на дорсальной поверхности трахеи) не обнаруживались после введения жидкости с помощью устройства с двойным магнитом, что обычно происходит с устройством с одним магнитом.Затем, когда один магнит был сконфигурирован так, чтобы отталкивать противоположные полюса (рис. 3с), количество частиц, видимых в поле зрения, не увеличивалось после доставки.Настройка обеих конфигураций магнитов является сложной задачей из-за высокой напряженности магнитного поля, которое соответственно притягивает или толкает магниты.Затем установка была изменена на один магнит, параллельный дыхательным путям, но проходящий через дыхательные пути под углом 90 градусов, так что силовые линии пересекали стенку трахеи ортогонально (рис. 3d), ориентация предназначена для определения возможности агрегации частиц на боковая стенка.наблюдаться.Однако в этой конфигурации не было идентифицируемого движения накопления МП или движения магнита.На основании всех этих результатов для исследования носителей генов in vivo была выбрана конфигурация с одним магнитом и 30-градусной ориентацией (рис. 3а).
Когда животное визуализировали несколько раз сразу после гуманного умерщвления, отсутствие мешающего движения ткани означало, что в чистом межхрящевом поле можно было различить более тонкие и более короткие линии частиц, «качающиеся» в соответствии с поступательным движением магнита.четко видеть присутствие и движение частиц MP6.
Титр LV-LacZ составлял 1,8 x 108 МЕ/мл, и после смешивания 1:1 с CombiMag MP (MP6) животным вводили 50 мкл трахеальной дозы 9 x 107 МЕ/мл носителя LV (т.е. 4,5 х 106 ТЕ/крыса).).).В этих исследованиях вместо перемещения магнита во время родов мы фиксировали магнит в одном положении, чтобы определить, можно ли (а) улучшить трансдукцию ЛЖ по сравнению с доставкой вектора в отсутствие магнитного поля и (б) можно ли обеспечить проходимость дыхательных путей. быть сосредоточены.Клетки трансдуцируются в области магнитных мишеней верхних дыхательных путей.
Присутствие магнитов и использование CombiMag в сочетании с векторами LV, по-видимому, не оказывали неблагоприятного воздействия на здоровье животных, как и наш стандартный протокол доставки векторов LV.Фронтальные изображения области трахеи, подвергнутой механическому возмущению (дополнительная рис. 1), показали, что группа, получавшая LV-MP, имела значительно более высокие уровни трансдукции в присутствии магнита (рис. 9а).В контрольной группе присутствовало лишь небольшое количество синего окрашивания LacZ (рис. 9b).Количественная оценка нормализованных областей, окрашенных X-Gal, показала, что введение LV-MP в присутствии магнитного поля приводило к примерно 6-кратному улучшению (рис. 9c).
Пример составных изображений, показывающих трансдукцию трахеи с помощью МП ЛЖ (а) в присутствии магнитного поля и (б) в отсутствие магнита.(c) Статистически значимое улучшение нормализованной площади трансдукции LacZ в трахее при использовании магнита (*p = 0,029, t-критерий, n = 3 на группу, среднее ± стандартная ошибка среднего).
Нейтральные быстро окрашенные в красный цвет срезы (пример, показанный на дополнительной рис. 2) показали, что окрашенные LacZ клетки присутствовали в том же образце и в том же месте, как сообщалось ранее.
Ключевой задачей генной терапии дыхательных путей остается точная локализация частиц-носителей в интересующих областях и достижение высокого уровня эффективности трансдукции в подвижном легком при наличии воздушного потока и активного клиренса слизи.Для носителей ЛВ, предназначенных для лечения респираторных заболеваний при муковисцидозе, увеличение времени пребывания частиц носителя в проводящих дыхательных путях до сих пор было недостижимой целью.Как указали Кастеллани и др., использование магнитных полей для усиления трансдукции имеет преимущества по сравнению с другими методами доставки генов, такими как электропорация, поскольку оно может сочетать в себе простоту, экономичность, локальную доставку, повышенную эффективность и более короткое время инкубации.и, возможно, более низкая доза носителя10.Однако in vivo отложение и поведение магнитных частиц в дыхательных путях под действием внешних магнитных сил никогда не описывались, и фактически способность этого метода повышать уровень экспрессии генов в интактных живых дыхательных путях не была продемонстрирована in vivo.
Наши эксперименты in vitro на синхротроне PCXI показали, что все протестированные нами частицы, за исключением полистирола MP, были видны в используемой нами установке визуализации.В присутствии магнитного поля магнитные поля образуют струны, длина которых связана с типом частиц и силой магнитного поля (т. е. близостью и движением магнита).Как показано на рисунке 10, струны, которые мы наблюдаем, формируются по мере того, как каждая отдельная частица намагничивается и индуцирует свое собственное локальное магнитное поле.Эти отдельные поля заставляют другие подобные частицы собираться и соединяться с групповыми струнными движениями из-за локальных сил от локальных сил притяжения и отталкивания других частиц.
Диаграмма, показывающая (а, б) цепочки частиц, образующихся внутри заполненных жидкостью капилляров, и (в, г) заполненную воздухом трахею.Обратите внимание, что капилляры и трахея нарисованы не в масштабе.Панель (а) также содержит описание МЖ, содержащего частицы Fe3O4, расположенные в виде цепочек.
При движении магнита над капилляром угол струны частиц достигал критического порога для МП3-5, содержащего Fe3O4, после чего струна частиц уже не оставалась в исходном положении, а перемещалась по поверхности в новое положение.магнит.Этот эффект, вероятно, возникает из-за того, что поверхность стеклянного капилляра достаточно гладкая, чтобы позволить этому движению произойти.Интересно, что MP6 (CombiMag) не вел себя таким образом, возможно, потому, что частицы были меньше, имели другое покрытие или заряд поверхности, или запатентованная жидкость-носитель влияла на их способность двигаться.Контраст на изображении частиц CombiMag также слабее, что позволяет предположить, что жидкость и частицы могут иметь одинаковую плотность и, следовательно, не могут легко двигаться навстречу друг другу.Частицы также могут застрять, если магнит движется слишком быстро, что указывает на то, что напряженность магнитного поля не всегда может преодолеть трение между частицами в жидкости, предполагая, что напряженность магнитного поля и расстояние между магнитом и целевой областью не должны учитываться. сюрприз.важный.Эти результаты также указывают на то, что, хотя магниты могут улавливать множество микрочастиц, проходящих через целевую область, маловероятно, что на магниты можно положиться при перемещении частиц CombiMag по поверхности трахеи.Таким образом, мы пришли к выводу, что исследования MF LV in vivo должны использовать статические магнитные поля для физического нацеливания на определенные области дерева дыхательных путей.
После того, как частицы доставлены в тело, их трудно идентифицировать в контексте сложной движущейся ткани тела, но их способность обнаружения была улучшена за счет горизонтального перемещения магнита над трахеей для «покачивания» струн MP.Хотя визуализация в режиме реального времени возможна, легче различить движение частиц после того, как животное было гуманно убито.Концентрации MP обычно были самыми высокими в этом месте, когда магнит располагался над областью визуализации, хотя некоторые частицы обычно обнаруживались дальше по трахее.В отличие от исследований in vitro, частицы не могут быть унесены в трахею движением магнита.Это открытие согласуется с тем, как слизь, покрывающая поверхность трахеи, обычно перерабатывает вдыхаемые частицы, задерживая их в слизи и впоследствии удаляя их через механизм мукоцилиарного клиренса.
Мы предположили, что использование магнитов выше и ниже трахеи для притяжения (рис. 3b) может привести к более однородному магнитному полю, а не к магнитному полю, которое сильно сконцентрировано в одной точке, что потенциально может привести к более равномерному распределению частиц..Однако наше предварительное исследование не нашло четких доказательств в поддержку этой гипотезы.Точно так же установка пары магнитов на отталкивание (рис. 3c) не привела к большему оседанию частиц в области изображения.Эти два вывода демонстрируют, что установка с двумя магнитами существенно не улучшает локальное управление наведением MP и что результирующие сильные магнитные силы трудно настроить, что делает этот подход менее практичным.Точно так же ориентация магнита выше и поперек трахеи (рис. 3d) также не увеличивала количество частиц, оставшихся в области изображения.Некоторые из этих альтернативных конфигураций могут оказаться неудачными, поскольку они приводят к снижению напряженности магнитного поля в зоне осаждения.Таким образом, конфигурация с одним магнитом под углом 30 градусов (рис. 3а) считается наиболее простым и эффективным методом тестирования in vivo.
Исследование LV-MP показало, что, когда векторы LV были объединены с CombiMag и доставлены после физического нарушения в присутствии магнитного поля, уровни трансдукции значительно увеличились в трахее по сравнению с контролем.Основываясь на исследованиях синхротронной визуализации и результатах LacZ, оказалось, что магнитное поле способно удерживать ЛЖ в трахее и уменьшать количество векторных частиц, которые немедленно проникают глубоко в легкое.Такие улучшения направленности могут привести к более высокой эффективности при одновременном снижении доставляемых титров, нецелевой трансдукции, воспалительных и иммунных побочных эффектов и затрат на перенос генов.Важно отметить, что, по словам производителя, CombiMag можно использовать в сочетании с другими методами переноса генов, включая другие вирусные векторы (например, AAV) и нуклеиновые кислоты.