Спасибо, что посетили Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Toxoplasma gondii представляет собой внутриклеточный простейший паразит, который модулирует микроокружение инфицированного хозяина и, как известно, связан с частотой роста опухоли головного мозга.В этом исследовании мы предполагаем, что экзосомальная миРНК-21 от токсоплазменной инфекции способствует росту опухоли головного мозга.Экзосомы из инфицированной токсоплазмой микроглии BV2 были охарактеризованы, и была подтверждена интернализация клеток глиомы U87.Профили экспрессии экзосомальных микроРНК анализировали с использованием массивов микроРНК и микроРНК-21A-5p, связанных с Toxoplasma gondii, и методом сортировки опухолей.Мы также исследовали уровни мРНК генов, связанных с опухолью, в клетках глиомы U87, изменяя уровни miR-21 в экзосомах и влияние экзосом на пролиферацию клеток глиомы U87 человека.В экзосомах клеток глиомы U87, инфицированных Toxoplasma gondii, повышена экспрессия микроРНК-21 и снижена активность противоопухолевых генов (FoxO1, PTEN и PDCD4).Экзосомы, происходящие из BV2, инфицированные токсоплазмой, вызывают пролиферацию клеток глиомы U87.Экзосомы индуцируют рост клеток U87 в модели опухоли мыши.Мы предполагаем, что повышенная экзосомальная миР-21 в инфицированной токсоплазмой микроглии BV2 может играть важную роль в качестве промотора роста клеток в клетках глиомы U87 путем подавления противоопухолевых генов.
По оценкам, в 2018 году во всем мире было диагностировано более 18,1 миллиона случаев запущенного рака, при этом ежегодно диагностируется около 297 000 опухолей центральной нервной системы (1,6% всех опухолей)1.Предыдущие исследования показали, что факторами риска развития опухолей головного мозга у человека являются различные химические продукты, семейный анамнез и ионизирующее излучение головного терапевтического и диагностического оборудования.Однако точная причина этих злокачественных новообразований неизвестна.Приблизительно 20% всех случаев рака во всем мире вызываются инфекционными агентами, включая вирусы, бактерии и паразиты3,4.Инфекционные патогены нарушают генетические механизмы клетки-хозяина, такие как репарация ДНК и клеточный цикл, и могут приводить к хроническому воспалению и повреждению иммунной системы5.
Инфекционные агенты, связанные с раком человека, являются наиболее распространенными вирусными патогенами, включая вирусы папилломы человека и вирусы гепатита В и С.Паразиты также могут играть потенциальную роль в развитии рака у человека.Несколько видов паразитов, а именно Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis и Hymenolepis nana, вызывают различные виды рака человека 6,7,8.
Toxoplasma gondii представляет собой внутриклеточное простейшее, регулирующее микроокружение инфицированных клеток-хозяев.По оценкам, этот паразит заражает примерно 30% населения мира, подвергая риску все население9,10.Toxoplasma gondii может инфицировать жизненно важные органы, включая центральную нервную систему (ЦНС), и вызывать серьезные заболевания, такие как смертельный менингит и энцефалит, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом9.Однако Toxoplasma gondii также может изменять среду инфицированного хозяина, модулируя рост клеток и иммунные реакции у иммунокомпетентных лиц, что приводит к поддержанию бессимптомной хронической инфекции9,11.Интересно, что, учитывая корреляцию между распространенностью T. gondii и заболеваемостью опухолью головного мозга, в некоторых сообщениях предполагается, что изменения окружающей среды хозяина in vivo из-за хронической инфекции T. gondii напоминают микроокружение опухоли.
Экзосомы известны как межклеточные коммуникаторы, которые доставляют биологический контент, включая белки и нуклеиновые кислоты, из соседних клеток16,17.Экзосомы могут влиять на биологические процессы, связанные с опухолью, такие как антиапоптоз, ангиогенез и метастазирование в микроокружении опухоли.В частности, miRNAs (miRNAs), малые некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, являются важными посттранскрипционными регуляторами генов, которые контролируют более 30% мРНК человека посредством miRNA-индуцированного комплекса молчания (miRISC).Toxoplasma gondii может нарушать биологические процессы, контролируя экспрессию микроРНК у инфицированных хозяев.miRNA хозяина содержат важные сигналы для регуляции биологических процессов хозяина для достижения стратегии выживания паразита.Таким образом, изучение изменений в профиле микроРНК хозяина при инфицировании T. gondii может помочь нам более четко понять взаимодействие между хозяином и T. gondii.Действительно, Тиругнанам и др.15 предположили, что T. gondii способствует канцерогенезу головного мозга, изменяя его экспрессию на специфических микроРНК хозяина, связанных с ростом опухоли, и обнаружили, что T. gondii может вызывать глиомы у экспериментальных животных.
Это исследование фокусируется на изменении экзосомальной миР-21 в микроглии хозяина, инфицированной Toxoplasma BV2.Мы наблюдали возможную роль измененной экзосомальной миР-21 в росте клеток глиомы U87 за счет удержания в ядре FoxO1/p27, который является мишенью сверхэкспрессированной миР-21.
Экзосомы, полученные из BV2, были получены с использованием дифференциального центрифугирования и проверены различными методами на предмет предотвращения загрязнения клеточными компонентами или другими везикулами.Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) показал различные закономерности между белками, экстрагированными из клеток BV2, и экзосомами (рис. 1A), а образцы были оценены на наличие Alix, который был проанализирован Вестерн-блоттингом экзосомальных белковых маркеров в .Мечение Alix было обнаружено в белках экзосом, но не в белках лизата клеток BV2 (Fig. 1B).Кроме того, очищенную РНК из экзосом, полученных из BV2, анализировали с помощью биоанализатора.18S и 28S рибосомные субъединицы редко наблюдались в картине миграции экзосомальной РНК, что указывает на надежную чистоту (рис. 1C).Наконец, просвечивающая электронная микроскопия показала, что наблюдаемые экзосомы имели размер около 60–150 нм и имели чашеобразную структуру, типичную для морфологии экзосом (рис. 1D).
Характеристика экзосом, полученных из клеток BV2.(A) Страница паспорта безопасности.Белки выделяли из клеток BV2 или экзосом, полученных из BV2.Белковые паттерны различаются между клетками и экзосомами.(B) Вестерн-блот анализ экзосомального маркера (Alix).(C) Оценка очищенной РНК из клеток BV2 и экзосом, полученных из BV2, с использованием биоанализатора.Так, 18S и 28S рибосомные субъединицы в клетках BV2 редко встречались в составе экзосомальной РНК.(D) Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что экзосомы, выделенные из клеток BV2, были отрицательно окрашены 2% уранилацетатом.Экзосомы имеют размер примерно 60-150 нм и чашеобразную форму (Song and Jung, неопубликованные данные).
Клеточная интернализация экзосом, происходящих из BV2, в клетки глиомы человека U87 наблюдалась с помощью конфокальной микроскопии.Меченые PKH26 экзосомы локализованы в цитоплазме клеток U87.Ядра были окрашены DAPI (рис. 2А), что указывает на то, что экзосомы, происходящие из BV2, могут интернализоваться клетками-хозяевами и влиять на среду клеток-реципиентов.
Интернализация экзосом, происходящих из BV2, в клетки глиомы U87 и экзосом, происходящих из BV2, инфицированных Toxoplasma RH, индуцировала пролиферацию клеток глиомы U87.(A) Экзосомы, поглощенные клетками U87, измеренные с помощью конфокальной микроскопии.Клетки глиомы U87 инкубировали с экзосомами, меченными PKH26 (красный), или без контроля в течение 24 часов.Ядра окрашивали DAPI (синий) и затем наблюдали под конфокальным микроскопом (масштабная линейка: 10 мкм, х 3000).(B) Пролиферацию клеток глиомы U87 определяли с помощью анализа пролиферации клеток.Клетки глиомы U87 обрабатывали экзосомами в течение указанного времени. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. * P <0,05 по критерию Стьюдента. *P < 0,05. * Р <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
После подтверждения интернализации экзосом, полученных из BV2, в клетки глиомы U87, мы провели анализы клеточной пролиферации, чтобы исследовать роль экзосом, полученных из токсоплазмы BV2, в развитии клеток глиомы человека.Обработка клеток U87 экзосомами из клеток BV2, инфицированных T. gondii, показала, что экзосомы, полученные из BV2, инфицированные T. gondii, вызывали значительно более высокую пролиферацию клеток U87 по сравнению с контролем (рис. 2B).
Кроме того, рост клеток U118 имел те же результаты, что и U87, поскольку экзосомы, стимулированные токсоплазмой, вызывали самые высокие уровни пролиферации (данные не показаны).Основываясь на этих данных, мы можем указать, что экзосомы, инфицированные токсоплазмой, происходящие из BV2, играют важную роль в пролиферации клеток глиомы.
Чтобы исследовать влияние экзосом, полученных из BV2, инфицированных токсоплазмой, на развитие опухоли, мы инъецировали клетки глиомы U87 голым мышам для модели ксенотрансплантата и вводили экзосомы, полученные из BV2, или экзосомы, полученные из BV2, инфицированные RH.После того как опухоли стали очевидными через 1 неделю, каждую экспериментальную группу из 5 мышей разделили в соответствии с размером опухоли, чтобы определить одну и ту же начальную точку, и размер опухоли измеряли в течение 22 дней.
У мышей с моделью ксенотрансплантата U87 значительно больший размер и масса опухоли наблюдались в группе RH-инфицированных экзосом, происходящих из BV2, на 22-й день (рис. 3A, B).С другой стороны, не было существенной разницы в размере опухоли между группой экзосом, полученной из BV2, и контрольной группой после лечения экзосомами.Кроме того, мыши, которым вводили клетки глиомы и экзосомы, визуально демонстрировали наибольший объем опухоли в группе RH-инфицированных экзосом, полученных из BV2 (рис. 3C).Эти результаты демонстрируют, что экзосомы, инфицированные токсоплазмой, происходящие из BV2, индуцируют рост глиомы в модели опухоли мыши.
Онкогенез (AC) экзосом, происходящих из BV2, на модели мыши с ксенотрансплантатом U87.Размер опухоли (A) и вес (B) были значительно увеличены у голых мышей BALB/c, получавших RH-инфицированные экзосомы, полученные из BV2.Голым мышам BALB/c (C) подкожно вводили 1×107 клеток U87, суспендированных в смеси Matrigel.Через шесть дней после инъекции мышам вводили 100 мкг экзосом, полученных из BV2.Размер и вес опухоли измеряли в указанные дни и после умерщвления соответственно. *Р < 0,05. *Р < 0,05. *Р < 0,05. *Р < 0,05. *Р <0,05。 *Р <0,05。 *Р < 0,05. *Р < 0,05.
Данные показали, что 37 miRNAs (16 с повышенной экспрессией и 21 с пониженной экспрессией), связанные с иммунитетом или развитием опухоли, были значительно изменены в микроглии после заражения штаммом Toxoplasma RH (Fig. 4A).Относительные уровни экспрессии миР-21 среди измененных миРНК были подтверждены с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени в экзосомах, полученных из BV2, экзосомах, обработанных клетками BV2 и U87.Экспрессия miR-21 показала значительное увеличение экзосом из клеток BV2, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм RH) (фиг. 4B).Относительные уровни экспрессии miR-21 в клетках BV2 и U87 увеличивались после поглощения измененных экзосом (Fig. 4B).Относительные уровни экспрессии miR-21 в тканях головного мозга опухолевых больных и мышей, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм ME49), были соответственно выше, чем в контроле (рис. 4C).Эти результаты коррелируют с различиями между уровнями экспрессии предсказанных и подтвержденных микроРНК in vitro и in vivo.
Изменения экспрессии экзосомальных miP-21a-5p в микроглии, инфицированной Toxoplasma gondii (RH).(A) Демонстрирует значительные изменения в siRNA, связанные с иммунитетом или развитием опухоли после инфицирования T. gondii RH.(B) Относительные уровни экспрессии miR-21 были обнаружены с помощью RT-PCR в реальном времени в экзосомах, полученных из BV2, экзосомах, обработанных BV2, и клетках U87.(C) Относительные уровни экспрессии miR-21 были обнаружены в тканях головного мозга пациентов с опухолями (N = 3) и мышей, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм ME49) (N = 3). *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с использованием t-критерия Стьюдента. *P < 0,05. * Р <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
Экзосомы из RH-инфицированных клеток BV2 приводили к росту глиом in vivo и in vitro (рис. 2, 3).Чтобы обнаружить соответствующие мРНК, мы исследовали уровни мРНК противоопухолевых генов-мишеней, вилкообразной коробки O1 (FoxO1), PTEN и запрограммированной гибели клеток 4 (PDCD4) в клетках U87, инфицированных экзосомами, полученными из BV2 или RH BV2.Биоинформатический анализ показал, что несколько генов, ассоциированных с опухолью, включая гены FoxO1, PTEN и PDCD4, имеют сайты связывания miR-2121,22.Уровни мРНК противоопухолевых генов-мишеней были снижены в RH-инфицированных экзосомах, происходящих из BV2, по сравнению с экзосомами, происходящими из BV2 (фиг. 5A).FoxO1 показал сниженный уровень белка в экзосомах, полученных из BV2, инфицированных RH, по сравнению с экзосомами, полученными из BV2 (рис. 5B).Основываясь на этих результатах, мы можем подтвердить, что экзосомы, полученные из RH-инфицированного BV2, подавляют антионкогенные гены, сохраняя свою роль в росте опухоли.
Экзосомы, полученные из BV2, инфицированные токсоплазмой RH, индуцируют супрессию противоопухолевых генов в клетках глиомы U87 экзосомами, полученными из BV2, инфицированными токсоплазмой RH.(A) ПЦР в реальном времени экспрессии FoxO1, PTEN и PDCD4 в экзосомах, полученных из BV2, инфицированного T. gondii RH, по сравнению с экзосомами PBS.мРНК β-актина использовали в качестве контроля.(B) Экспрессия FoxO1 была определена вестерн-блоттингом, а данные денситометрии были статистически оценены с использованием программы ImageJ. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с использованием t-критерия Стьюдента. *P < 0,05. * Р <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
Чтобы понять влияние miP-21 в экзосомах на регуляцию генов, ассоциированных с опухолью, клетки U87 трансфицировали ингибитором miP-21 с использованием липофектамина 2000, и клетки собирали через 24 часа после трансфекции.Уровни экспрессии FoxO1 и p27 в клетках, трансфицированных ингибиторами miR-21, сравнивали с клетками, обработанными экзосомами, полученными из BV2, с использованием qRT-PCR (фиг. 6A, B).Трансфекция ингибитора miR-21 в клетки U87 значительно снижала экспрессию FoxO1 и p27 (фиг. 6).
RH-инфицированный экзосомальный белок miP-21, происходящий из BV2, изменял экспрессию FoxO1/p27 в клетках глиомы U87.Клетки U87 трансфицировали ингибитором miP-21 с использованием липофектамина 2000 и клетки собирали через 24 часа после трансфекции.Уровни экспрессии FoxO1 и p27 в клетках, трансфицированных ингибиторами miR-21, сравнивали с уровнями в клетках, обработанных экзосомами, полученными из BV2, с использованием qRT-PCR (A, B).
Чтобы избежать иммунного ответа хозяина, паразит токсоплазмы трансформируется в тканевую кисту.Они паразитируют в различных тканях, включая мозг, сердце и скелетные мышцы, на протяжении всей жизни хозяина и модулируют иммунный ответ хозяина.Кроме того, они могут регулировать клеточный цикл и апоптоз клеток-хозяев, способствуя их пролиферации14,24.Toxoplasma gondii преимущественно поражает дендритные клетки хозяина, нейтрофилы и линию моноцитов/макрофагов, включая микроглию головного мозга.Toxoplasma gondii индуцирует дифференцировку макрофагов фенотипа М2, влияет на заживление ран после инфицирования патогеном, а также связана с гиперваскуляризацией и гранулематозным фиброзом.Этот поведенческий патогенез токсоплазменной инфекции может быть связан с маркерами, связанными с развитием опухоли.Враждебная среда, регулируемая токсоплазмой, может напоминать соответствующий предрак.Поэтому можно предположить, что токсоплазменная инфекция должна способствовать развитию опухолей головного мозга.Фактически, сообщалось о высоких показателях заражения токсоплазмой в сыворотке пациентов с различными опухолями головного мозга.Кроме того, Toxoplasma gondii может быть еще одним канцерогенным эффектором и действовать синергетически, помогая другим инфекционным канцерогенам развить опухоли головного мозга.В связи с этим стоит отметить, что P. falciparum и вирус Эпштейна-Барр синергически способствуют формированию лимфомы Беркитта.
Роль экзосом как регуляторов в области исследований рака была тщательно исследована.Однако роль экзосом между паразитами и инфицированными хозяевами остается малоизученной.До сих пор различные регуляторы, включая секретируемые белки, объясняли биологические процессы, с помощью которых простейшие паразиты сопротивляются атаке хозяина и сохраняют инфекцию.В последнее время ширится концепция, согласно которой микровезикулы, ассоциированные с простейшими, и их микроРНК взаимодействуют с клетками-хозяевами, создавая благоприятную среду для их выживания.Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы обнаружить взаимосвязь между измененными экзосомальными микроРНК и пролиферацией клеток глиомы.Изменение микроРНК (кластерные гены miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 и miR-17-92) связывается с промотором STAT3 в инфицированных токсоплазмой макрофагах человека, регулируется и индуцирует антигены. -апоптоз в ответ на инфекцию Toxoplasma gondii 29 .Инфекция токсоплазмой увеличивает экспрессию miR-17-5p и miR-106b-5p, которые ассоциированы с несколькими гиперпролиферативными заболеваниями 30 .Эти данные свидетельствуют о том, что микроРНК хозяина, регулируемые токсоплазменной инфекцией, являются важными молекулами для выживания и патогенеза паразита в биологическом поведении хозяина.
Измененные микроРНК могут влиять на различные типы поведения при инициации и прогрессировании злокачественных клеток, включая глиомы: самодостаточность сигналов роста, нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост, уклонение от апоптоза, неограниченный репликативный потенциал, ангиогенез, инвазию и метастазирование, воспаление.При глиоме измененные miRNAs были идентифицированы в нескольких исследованиях профилей экспрессии.
В настоящем исследовании мы подтвердили высокий уровень экспрессии микроРНК-21 в клетках-хозяевах, инфицированных токсоплазмой.miR-21 была идентифицирована как одна из наиболее часто сверхэкспрессируемых микроРНК в солидных опухолях, включая глиомы, 33 и ее экспрессия коррелирует со степенью глиомы.Накопленные данные свидетельствуют о том, что miR-21 является новым онкогеном, который действует как антиапоптотический фактор при росте глиомы и имеет высокую сверхэкспрессию в тканях и плазме злокачественных новообразований головного мозга человека.Интересно, что инактивация miR-21 в клетках и тканях глиомы запускает ингибирование клеточной пролиферации за счет каспаз-зависимого апоптоза.Биоинформационный анализ предсказанных мишеней miR-21 выявил несколько генов-супрессоров опухолей, связанных с путями апоптоза, включая запрограммированную гибель клеток 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN и forkhead box O1 (FoxO1) с сайтом связывания miR-2121..22.38.
FoxO1, как один из факторов транскрипции (FoxO), участвует в развитии различных видов рака человека и может регулировать экспрессию генов-супрессоров опухолей, таких как p21, p27, Bim и FasL40.FoxO1 может связывать и активировать ингибиторы клеточного цикла, такие как p27, для подавления роста клеток.Более того, FoxO1 является ключевым эффектором передачи сигналов PI3K/Akt и регулирует многие биологические процессы, такие как развитие клеточного цикла и дифференцировка клеток посредством активации транскрипции p2742.
В заключение мы считаем, что экзосомальная миР-21, полученная из инфицированной токсоплазмой микроглии, может играть важную роль в качестве регулятора роста клеток глиомы (рис. 7).Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти прямую связь между экзосомальной миР-21, измененной токсоплазменной инфекцией и ростом глиомы.Ожидается, что эти результаты станут отправной точкой для изучения взаимосвязи между токсоплазменной инфекцией и заболеваемостью глиомой.
В данном исследовании предложена принципиальная схема механизма канцерогенеза глиомы (головного мозга).Автор рисует в PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Все экспериментальные протоколы в этом исследовании, включая использование животных, соответствовали Стандартным этическим принципам Комитета по уходу за животными и пользователям Сеульского национального университета и были одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинской школы Сеульского национального университета (номер IRB SNU- 150715).-2).Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Клетки микроглии мыши BV2 и клетки глиомы человека U87 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) и среде Мемориального института Розуэлл-Парк (RPMI; Welgene), соответственно, каждая из которых содержала 10% фетальной бычьей сыворотки, 4 мМ л- глутамина, 0,2 мМ пенициллина и 0,05 мМ стрептомицина.Клетки культивировали в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С.Другую клеточную линию глиомы, U118, использовали для сравнения с клетками U87.
Для выделения экзосом из штаммов RH и ME49, инфицированных T. gondii, тахизоиты T. gondii (штамм RH) собирали из брюшной полости 6-недельных мышей BALB/c, инъецированных за 3-4 дня до этого.Тахизоиты трижды промывали PBS и очищали центрифугированием в 40% Percoll (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США)43.Для получения тахизоитов штамма ME49 мышам BALB/c внутрибрюшинно вводили 20 тканевых кист и собирали тахизоитную трансформацию в цистах путем промывания брюшной полости на 6-8-й день после заражения (PI).Мыши, инфицированные PBS.Тахизоиты ME49 выращивали в клетках с добавлением 100 мкг/мл пенициллина (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco/BRL) и 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Lonza, Walkersville, MD). .., США) при 37 °C и 5% углекислого газа.После культивирования в клетках Vero тахизоиты ME49 дважды пропускали через иглу 25 размера, а затем через фильтр 5 мкм для удаления дебриса и клеток.После промывки тахизоиты ресуспендировали в PBS44.Тканевые цисты штамма Toxoplasma gondii ME49 поддерживали путем внутрибрюшинной инъекции цист, выделенных из головного мозга инфицированных мышей C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Мозг мышей, инфицированных ME49, собирали через 3 месяца PI и измельчали ​​под микроскопом для выделения цист.Инфицированные мыши содержались в специальных условиях, свободных от патогенов (SPF), в Медицинской школе Сеульского национального университета.
Тотальную РНК экстрагировали из экзосом, происходящих из BV2, клеток и тканей BV2, с использованием набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя, включая время инкубации для стадии элюирования.Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000.Качество микрочипов РНК оценивали с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Нидерланды).
DMEM с 10% бедной экзосомами FBS готовили ультрацентрифугированием при 100000g в течение 16 часов при 4°C и фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Nalgene, Rochester, NY, USA).Клетки BV2, 5 × 105, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% экзосомно-истощенной FBS и 1% антибиотиков, при 37°C и 5% CO2.Через 24 часа инкубации к клеткам добавляли тахизоиты штамма RH или ME49 (MOI = 10) и не вторгшихся паразитов удаляли в течение часа и снова заполняли DMEM.Экзосомы из клеток BV2 выделяли модифицированным дифференциальным центрифугированием, наиболее широко используемым методом.Ресуспензируйте осадок экзосомы в 300 мкл PBS для анализа РНК или белка.Концентрацию выделенных экзосом определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) и спектрофотометра NanoDrop 2000.
Осадки из клеток BV2 или экзосомы, полученные из BV2, лизировали в растворе для экстракции белков PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) и белки загружали в окрашенные кумасси бриллиантовым синим 10% SDS полиакриламидные гели.Кроме того, белки переносили на мембраны PVDF в течение 2 часов.Вестерн-блоты были проверены с использованием антитела Alix (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США) в качестве экзосомального маркера.В качестве вторичного антитела использовали конъюгированный с HRP козий антимышиный IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) и анализатор люминесцентных изображений LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan)..Трансмиссионную электронную микроскопию проводили для изучения размера и морфологии экзосом.Экзосомы, выделенные из клеток BV2 (6,40 мкг/мкл), готовили на сетках с углеродным покрытием и отрицательно окрашивали 2% уранилацетатом в течение 1 мин.Подготовленные образцы наблюдали при ускоряющем напряжении 80 кВ с использованием JEOL 1200-EX II (Токио, Япония), оснащенного ПЗС-камерой ES1000W Erlangshen (Gatan, Плезантон, Калифорния, США).
Экзосомы, полученные из BV2, окрашивали с использованием набора красных флуоресцентных линкеров PKH26 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 15 минут при комнатной температуре.Клетки U87, 2×105, с меченными PKH26 экзосомами (красные) или без экзосом в качестве отрицательного контроля, инкубировали при 37°C в течение 24 часов в инкубаторе с 5% CO2.Ядра клеток U87 окрашивали DAPI (синий), клетки U87 фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при 4°C, а затем анализировали в системе конфокального микроскопа Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Мангейм, Германия).наблюдаемый.
кДНК синтезировали из миРНК с использованием синтеза первой цепи миРНК Mir-X и набора SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) с использованием праймеров и матриц, смешанных с SYBR Premix.ДНК амплифицировали в течение 40 циклов денатурации при 95°С в течение 15 с и отжига при 60°С в течение 60 с.Данные каждой реакции ПЦР анализировали с использованием модуля анализа данных программного обеспечения оптической системы iQ™5 (Bio-Rad).Относительные изменения в экспрессии генов между выбранными генами-мишенями и β-актином/миРНК (и U6) рассчитывали с использованием метода стандартной кривой.Используемые последовательности праймеров показаны в таблице 1.
3 x 104 клеток глиомы U87 высевали в 96-луночные планшеты и смешивали с зараженными токсоплазмой экзосомами, полученными из BV2 (50 мкг/мл), или неимпульсными экзосомами, полученными из BV2 (50 мкг/мл), в качестве контроля через 12, 18 и 36 часов. .Скорость пролиферации клеток определяли с использованием набора Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (дополнительные рисунки S1-S3) 46 .
5-недельных самок голых мышей BALB/c приобретали у Orient Bio (Соннам-си, Южная Корея) и содержали индивидуально в стерильных клетках при комнатной температуре (22±2°C) и влажности (45±15°C).%) при комнатной температуре (22±2°С) и влажности (45±15%).12-часовой световой цикл и 12-часовой цикл темноты были выполнены с SPF (Центр животных Медицинской школы Сеульского национального университета).Мышей случайным образом разделили на три группы по 5 мышей в каждой, и всем группам подкожно инъецировали 400 мл PBS, содержащего 1×107 клеток глиомы U87, и BD Matrigel™ с пониженным содержанием фактора роста (BD Science, Майами, Флорида, США).Через шесть дней после инъекции опухоли в участок опухоли вводили 200 мг экзосом, полученных из клеток BV2 (с/без токсоплазменной инфекции).Через двадцать два дня после заражения опухолью у мышей в каждой группе измеряли штангенциркулем три раза в неделю и рассчитывали объем опухоли по формуле: 0,5×(ширина)×2×длина.
Анализ экспрессии микроРНК с использованием массива микроРНК miRCURYTM LNA, массивы 7-го поколения с массивами mmu и rno (EXIQON, Vedbaek, Дания), охватывающий 1119 хорошо охарактеризованных мышей среди 3100 зондов для захвата микроРНК человека, мыши и крысы.Во время этой процедуры от 250 до 1000 нг общей РНК удаляли из 5'-фосфата путем обработки щелочной фосфатазой кишечника телят с последующим мечением зеленым флуоресцентным красителем Hy3.Затем меченые образцы гибридизовали путем загрузки предметных стекол с использованием набора для гибридизационной камеры (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и набора предметных стекол для гибридизации (Agilent Technologies).Гибридизацию проводили в течение 16 часов при 56°С, затем микрочипы промывали в соответствии с рекомендациями производителя.Затем обработанные предметные стекла с микрочипами сканировали с использованием системы сканирования микрочипов Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Отсканированные изображения были импортированы с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction версии 10.7.3.1 (Agilent Technologies), и интенсивность флуоресценции каждого изображения была количественно определена с использованием соответствующего файла GAL модифицированного протокола Exiqon.Данные микрочипов для текущего исследования депонированы в базе данных GEO под регистрационным номером GPL32397.
Профили экспрессии зрелых экзосомальных микроРНК в микроглии штаммов RH или ME49, инфицированных токсоплазмой, анализировали с использованием различных сетевых инструментов.miRNAs, связанные с развитием опухоли, были идентифицированы с использованием miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) и отфильтрованы с нормализованной интенсивностью сигнала (log2) выше 8,0.Было обнаружено, что среди микроРНК дифференциально экспрессируемые микроРНК более чем в 1,5 раза изменены фильтрующим анализом микроРНК, измененных штаммами RH или ME49, инфицированными T. gondii.
Клетки высевали в шестилуночные планшеты (3×105 клеток/лунку) в среде opti-MEM (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).Трансфицированные клетки культивировали в течение 6 часов, а затем среду меняли на свежую полную среду.Клетки собирали через 24 часа после трансфекции.
Статистический анализ в основном проводили с использованием t-критерия Стьюдента с программным обеспечением Excel (Microsoft, Вашингтон, округ Колумбия, США).Для экспериментального анализа на животных выполняли двухсторонний ANOVA с использованием программного обеспечения Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Значения P <0,05 Значения P<0,05 считались статистически значимыми. P 值< 0,05. Р ≤ < 0,05 Значения P <0,05 Значения P<0,05 считались статистически значимыми.
Все экспериментальные протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинской школы Сеульского национального университета (номер IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Ферли, Дж. и др.Расчетная глобальная заболеваемость раком и смертность от рака в 2018 г.: источники и методы GLOBOCAN.Интерпретация.Дж. Рак 144, 1941–1953 (2019).
Рашид, С., Рехман, К. и Акаш, М.С. Взгляд на факторы риска опухолей головного мозга и их терапевтические вмешательства. Рашид, С., Рехман, К. и Акаш, М.С. Взгляд на факторы риска опухолей головного мозга и их терапевтические вмешательства.Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Обзор факторов риска опухолей головного мозга и основных терапевтических вмешательств. Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Глубокое понимание факторов риска опухоли головного мозга и терапевтических вмешательств.Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Обзор факторов риска опухолей головного мозга и основных терапевтических вмешательств.Биомедицинская наука.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Като И., Чжан Дж. и Сун Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и женских половых путей: сводка эпидемиологических и лабораторных данных. Като И., Чжан Дж. и Сун Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и женских половых путей: сводка эпидемиологических и лабораторных данных.Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и женских половых органов: сводка эпидемиологических и лабораторных данных. Като, И., Чжан, Дж. и Сун, Дж. Като, И., Чжан, Дж. и Сун, Дж. Бактерио-вирусное взаимодействие в пищеварении ротовой полости человека и женских репродуктивных путях: краткое изложение популярных научных данных о болезнях и лабораторных данных.Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и раке женских половых органов: сводка эпидемиологических и лабораторных данных.Рак 14, 425 (2022).
Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углеродный и липидный метаболизм клетки-хозяина. Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углеродный и липидный метаболизм клетки-хозяина.Махон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. Перерождение инфекции в рак: как опухолевые вирусы на основе ДНК изменяют центральный углеродный и липидный метаболизм клетки-хозяина. Магон, К.Л. и Пэриш, Д.Л. Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углеродный и липидный метаболизм клетки-хозяина.Махон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. Превращает инфекцию в рак: как ДНК опухолевых вирусов изменяет центральный углеродный и липидный метаболизм в клетках-хозяевах.Открытая биология.11, 210004 (2021).
Коррейя да Коста, Дж.М. и др.Катехоловые эстрогены шистосом и печеночных сосальщиков и гельминтоассоциированный рак.фронт.жарко внутри.5, 444 (2014).