Лямблии двенадцатиперстной кишки — паразитический организм, вызывающий лямблиоз — кишечную инфекцию, особенно часто встречающуюся у маленьких детей с клиническими признаками диареи.Ранее мы сообщали, что внеклеточный G. duodenalis запускает активацию нуклеотидов, связывающих внутриклеточный олигомеризационно-подобный рецептор 3 (NLRP3), и регулирует воспалительные реакции хозяина посредством секреции внеклеточных везикул (EV).Однако точные молекулярные структуры патоген-ассоциированного дуоденококкового ЭВ (GEV), участвующих в этом процессе, и роль воспаления NLRP3 в лямблиозе еще предстоит выяснить.
Рекомбинантные эукариотические экспрессирующие плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 и альфа-7.3 гиардины в GEV были сконструированы, трансфицированы в первичные перитонеальные макрофаги мыши и обнаружены путем измерения молекулы-мишени воспаления каспазы-1.Проверяли уровень экспрессии р20..Гиардины G. duodenalis альфа-2 и альфа-7.3 первоначально были идентифицированы путем измерения воспаления NLRP3 (NLRP3, проинтерлейкин-1 бета [IL-1β], прокаспаза-1 и каспаза-1 p20), секреции IL.1β, уровни олигомеризации апоптотического пятнистого белка (ASC) и иммунофлуоресцентную локализацию NLRP3 и ASC.Роль воспаления NLRP3 в патогенности G. duodenalis затем оценивали на мышах, у которых была заблокирована активация NLRP3 (мыши с блокировкой NLRP3), и отслеживали патологические изменения массы тела, паразитарной нагрузки двенадцатиперстной кишки и ткани двенадцатиперстной кишки.Кроме того, мы исследовали, индуцируют ли гиардины альфа-2 и альфа-7.3 секрецию IL-1β in vivo через инфламмасому NLRP3, и определили роль этих молекул в патогенности G. duodenalis у мышей.
Альфа-2 и альфа-7.3 гиардины индуцируют активацию воспаления NLRP3 in vitro.Это приводило к активации р20-каспазы-1, повышению уровня экспрессии белков NLRP3, про-IL-1β и про-каспазы-1, значительному увеличению секреции IL-1β, образованию пятен АСК в цитоплазме и индукция олигомеризации АСК.Воспаление NLRP3 Потеря полового члена усугубляет патогенность G. duodenalis у мышей.У мышей, получавших кисты через зонд от мышей с блокировкой NLRP3, наблюдалось повышенное количество трофозоитов и серьезное повреждение ворсинок двенадцатиперстной кишки, характеризующееся некротическими криптами со сморщенными и ветвящимися.Эксперименты in vivo показали, что гиардины альфа-2 и альфа-7.3 могут индуцировать секрецию IL-1β через воспалительную сому NLRP3, а иммунизация лямблинами альфа-2 и альфа-7.3 снижает патогенность G. duodenalis у мышей.
В совокупности результаты этого исследования позволяют предположить, что лямблии альфа-2 и альфа-7.3 вызывают усиление воспаления NLRP3 хозяина и снижают инфекционность G. duodenalis у мышей, которые являются многообещающими мишенями для предотвращения лямблиоза.
Giardia duodenum — внеклеточный простейший паразит, обитающий в тонком кишечнике и вызывающий ежегодно 280 миллионов случаев лямблиоза с диареей, особенно среди детей раннего возраста в развивающихся странах [1].Люди заражаются через питьевую воду или пищу, загрязненную цистами M. duodenum, которые затем попадают в желудок и выделяются с желудочными соками.Трофозоиты Giardia duodenum прикрепляются к эпителию двенадцатиперстной кишки, вызывая тошноту, рвоту, диарею, боли в животе и потерю веса.Восприимчивы к инфекции люди с иммунодефицитом и муковисцидозом.Заражение может также произойти при оральном и анальном сексе [2].Такие препараты, как метронидазол, тинидазол и нитазоксанид, являются предпочтительными вариантами лечения инфекций двенадцатиперстной кишки [3].Однако эти химиотерапевтические препараты вызывают побочные эффекты, такие как тошнота, канцерогенез и генотоксичность [4].Следовательно, необходимо разработать более эффективные стратегии для предотвращения заражения G. duodenalis.
Инфламмасомы представляют собой класс цитозольных белковых комплексов, которые являются частью врожденного иммунного ответа, помогая защищаться от инвазии патогенов и опосредовать воспалительные реакции [5].Среди этих воспалений нуклеотид-связывающая олигомеризация (NLRP3), подобная нуклеотидсвязывающей олигомеризации (NLRP3), подобная воспалению, была тщательно изучена, поскольку ее можно обнаружить с помощью различных молекулярных паттернов, связанных с патогеном/повреждением (PAMP/ DAMP), распознает и активирует врожденную иммунную систему.и регулирует гомеостаз кишечника при многих воспалительных заболеваниях [6,7,8].Он состоит из рецептора распознавания образов (PRR) NLRP3, адаптерного апоптотического пятнистого белка (ASC) и эффекторной прокаспазы-1 или прокаспазы-11.Воспаление NLRP3 действует как хозяин против инвазии патогенов, как это наблюдалось в исследованиях Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] и Leishmania.[11], но также сообщалось, что активация воспаления NLRP3 ограничивает защитные иммунные реакции и усугубляет прогрессирование заболевания, например, у червей [12].Основываясь на наших предыдущих результатах, мы сообщили, что внеклеточный G. duodenalis запускает внутриклеточную активацию воспаления NLRP3 и модулирует воспалительные реакции хозяина путем секреции внеклеточных везикул (ВВ) [13].Однако роль воспаления NLRP3 в инфекции G. duodenalis in vivo еще предстоит определить.
Первоначально гирдины были описаны как структурные компоненты цитоскелета G. duodenalis и играют важную роль в подвижности трофозоитов и прикреплении эпителиальных клеток в тонком кишечнике.Для лучшей адаптации к окружающей среде и повышения своей патогенности трофозоиты G. duodenalis развили уникальную структуру цитоскелета, состоящую из 8 жгутиков, 1 среднего тела и 1 вентрального диска [14].Трофозоиты Giardia duodenum используют свой цитоскелет для проникновения в верхний отдел тонкой кишки, особенно в двенадцатиперстную кишку, и прикрепляются к энтероцитам.Они постоянно мигрируют и прикрепляются к эпителиальным клеткам с помощью клеточного метаболизма.Следовательно, существует тесная связь между их цитоскелетом и вирулентностью.Жардины, специфичные для Giardia duodenum, являются компонентами структуры цитоскелета [15] и делятся на четыре класса: α-, β-, γ- и δ-лямблины.Существует 21 член семейства α-гиардинов, каждый из которых обладает кальций-зависимой способностью связывать фосфолипиды [16].Они также соединяют цитоскелет с клеточной мембраной.У лиц с диареей, вызванной G. duodenalis, α-гиардины высоко экспрессируются и иммунореактивны во время инфекции [17].Гетерологичные вакцины на основе лямблий альфа-1 защищают от лямблиоза у мышей и являются потенциальными антигенами-кандидатами для разработки вакцин [18].Альфа-8 гиардин, локализованный в плазматической мембране и жгутиках, но не в вентральном диске, усиливает подвижность и скорость роста трофозоитов G. duodenalis [19].Альфа-14 гиардин прикрепляется к структурам микротрубочек на жгутиках и влияет на жизнеспособность G. duodenalis [20].Альфа-11 гиардин присутствует в изобилии на протяжении всего жизненного цикла, а сверхэкспрессия альфа-11 гиардина повреждает сам G. duodenalis [21].Однако неясно, защищают ли гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 от инфекции G. duodenalis и лежащих в ее основе механизмов.
В этом исследовании рекомбинантные эукариотические экспрессирующие плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардин и pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 гиардин были трансфицированы в первичные перитонеальные макрофаги мыши для активации NLRP3 хозяина.Затем подвергали скринингу мишени воспалительных заболеваний.Мы также оценили роль воспаления NLRP3 в патогенности G. duodenalis, исследовали, индуцируют ли альфа-2 и альфа-7,3 гиардины активацию воспаления NLRP3 in vivo, и определили, что эти две роли лямблинов в патогенности G. duodenalis Г. дуоденалис.Нашей общей целью было разработать многообещающие мишени для профилактики инфекции G. duodenalis.
Самки мышей дикого типа (WT) C57BL/6 в возрасте 5–8 недель были приобретены в Центре экспериментальных животных Ляонин Чаншэн (Ляонин, Китай).Мыши имели свободный доступ к воде, получали стерилизованный корм и содержались при 12/12-часовом цикле света/темноты.Перед заражением мыши получали антибиотики ad libitum с питьевой водой с добавлением ампициллина (1 мг/мл), ванкомицина (1 мг/мл) и неомицина (1,4 мг/мл) (все закуплены в Шанхае, Китай, искусственные организмы) [22] ].].Мышей, потерявших способность есть и пить на >24 часов и потерявших ≥ 20% массы тела, гуманно умерщвляли путем смещения шейных позвонков.
Трофозоиты WB G. duodenalis (Американская коллекция типовых культур, Манассас, США) были дополнены 12,5% фетальной бычьей сывороткой (FBS; Every Green, Чжэцзян, Китай) и 0,1% бычьей желчью (Sigma-Aldrich, Сент-Миссури, США). ).США) в микроаэробных условиях.Сливающиеся трофозоиты собирали на льду и пассировали в соотношении 1:4 для дальнейшего размножения.
Кисты лямблий двенадцатиперстной кишки индуцировали, как описано ранее [23], трофозоиты собирали в логарифмической фазе, а затем разводили средой, индуцирующей инкапсуляцию, pH 7,1 (модифицированный TYI-S-33) до конечной концентрации 1 × 106 трофозоитов/мл.концентрация желчи 0,05% средняя).Трофозоиты культивировали в анаэробных условиях при 37°С до логарифмической фазы роста.Замените среду на среду, индуцирующую кисты (рН 7,8; ​​модифицированная среда TYI-S-33 с концентрацией желчи 1%) и культуру G. duodenalis при 37°С в течение 48–96 часов, в течение которых образование кист наблюдали под микроскопом.После того как большинство трофозоитов индуцировали образование цист, культуральную смесь собирали и ресуспендировали в стерильной деионизированной воде для лизирования оставшихся трофозоитов.Цисты подсчитывали и хранили при 4°С для последующего анализа через желудочный зонд на мышах.
Внеклеточные везикулы лямблий (ВГВ) обогащали, как описано ранее [13].Трофозоиты в логарифмической фазе роста ресуспендировали в модифицированной среде TYI-S-33, приготовленной с обедненной экзосомами FBS (Biological Industries, Бейт-Хаэмек, Израиль) до конечной концентрации 1 × 106 паразитов/мл и инкубировали в течение 12 часов.выделяли из культурального супернатанта центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин, 10 000 g в течение 45 мин и 100 000 g в течение 60 мин.Осадки растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS), определяли количественно с использованием набора для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и хранили при -80°С или использовали непосредственно для дальнейших анализов.
Первичные перитонеальные макрофаги мыши готовили, как описано ранее [24].Вкратце, мышам (в возрасте 6-8 недель) вводили (внутрибрюшинно [внутрибрюшинно]) 2,5 мл 2,98% жидкой тиогликолевой среды Difco (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) и кормили 3-4 нёба.Взвесь макрофагов собирали из брюшной полости мышей после эвтаназии и центрифугировали 3 раза при 1000 g по 10 мин.Собранные клетки детектировали методом проточной цитометрии с использованием маркера CD11b до тех пор, пока чистота клеток не достигала >98%, затем добавляли в 6-луночные планшеты для культивирования клеток (4,5×106 клеток/лунку) и инкубировали с 10% FBS (Bioindustry) при 37°C.и 5% CO2.
РНК экстрагировали из 1 × 107 трофозоитов в 1 мл реагента TRIzol (Vazyme, Нанкин, Китай), геномную ДНК экстрагировали из тотальной РНК G. duodenalis с помощью dsDNase MonScript (Monad, Ухань, Китай) и синтезировали комплементарную ДНК (кДНК). с помощью MonScript RTIIII Super Mix (Monad) согласно инструкции производителя.
Информация о последовательности CDS для целевого гена G. duodenalis была получена из GenBank NCBI.Используйте Primer 5.0 для разработки конкретных праймеров для бесшовного клонирования для каждого целевого гена.Прямой праймер (5'-3') состоит из трех частей: перекрывающейся последовательности с линеаризованным вектором pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) и стартовыми кодонами ATG и GNN (если первое основание не G).Это сделано для повышения эффективности выражения.Кроме того, не менее 16 пар оснований в сочетании (содержание GC 40–60%/Tm около 55 °C).Обратный праймер (5'-3') состоит из двух частей: перекрывающейся последовательности с линеаризованным EcoRV вектором pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) и комбинированного основания длиной не менее 16 п.о.(исключая две последние остановки).основания) кодон, такой как AA или GA, позволяющий рекомбинантным плазмидам экспрессировать свои меченые белки).Последовательности праймеров приведены в таблице 1 и были синтезированы компанией Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чанчунь, Китай).
Мишени амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Pfu (Tiangen, Пекин, Китай) или Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекин, Китай) с использованием подготовленной кДНК G. duodenalis в качестве матрицы.Плазмиду эукариотического вектора экспрессии pcDNA3.1(+) линеаризовали с помощью фермента рестрикции EcoRV и дефосфорилировали с использованием Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Линеаризованные фрагменты pcDNA3.1(+) и амплифицированные фрагменты целевого гена очищали с использованием набора для очистки геля ДНК (Tiangen) и количественно определяли с использованием Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Фрагмент pcDNA3.1(+) и каждый фрагмент целевого гена рекомбинировали с использованием смеси для клонирования одной сборки MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Сучжоу, Китай) и подтверждали секвенированием ДНК с использованием Comate Bioscience Company Limited (Чанчунь, Китай)..
Не содержащие эндотоксинов плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 и pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 были созданы с использованием мини-набора SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Концентрацию поддерживали выше 500 нг/мкл, чтобы гарантировать, что ЭДТА в элюирующем буфере не мешает анализу трансфекции.Первичные перитонеальные макрофаги мыши культивировали в 6-луночных планшетах с полной средой RPMI 1640 (Biological Industries) в течение 12 часов, затем клетки 3 раза промывали теплым PBS для удаления пенициллина и стрептомицина, а затем в среде, дополненной полной средой.Не содержащие эндотоксинов плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 и pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 (2,5 мкг) разводили в 125 мкл восстановленной сывороточной среды Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Затем 5 мкл реагента для трансфекции Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) разводили в 125 мкл среды Opti-MEM с низким содержанием сыворотки.Приготовьте комплексы липосома-ДНК, смешав разбавленную не содержащую эндотоксинов плазмиду с липофектамином 2000 и оставив смесь при комнатной температуре в течение 5 минут.Перенесите комплексы отдельно в клетки в каждой лунке и медленно перемешайте.Через 4 часа среду для культуры клеток заменяли 2 мл полной среды RPMI 1640 и культуру продолжали в течение 24 часов.К клеткам добавляли свежую культуральную среду и инкубировали в течение различных моментов времени в зависимости от схемы анализа.
Образцы белков из супернатантов и клеточных лизатов готовили, как описано ранее [25].Параметры мембранного переноса про-IL-1β, прокаспазы-1, каспазы-1 p20, NLRP3, β-актина и His-метки составляли 200 мА/90 мин.Для интерлейкина 1β (IL-1β; R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США), каспазы-1 (p20) (Adipogen, Швейцария) и NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швейцария) и 1:5000, нацеленного на His-метку (Amylet Scientific, Ухань, Китай) и β-актин (Proteintech, Ухань, Китай).
Сшивание дисукцинимида субератом (DSS) проводили, как описано ранее [26].Клетки промывали 3 раза холодным PBS и полностью лизировали иглой 27 калибра в 50 мкл реакционного буфера ASC (рН 8,0), содержащего 25 мМ Na2PO4, 187,5 мМ NaCl, 25 мМ HEPES и 125 мМ NaHCO3.Смесь центрифугировали при 5000 g в течение 3 минут и осадок зашивали 10 мкл DSS (25 мМ в ДМСО) и 40 мкл реакционного буфера ASC в течение 30 минут при 37°C.После центрифугирования при 5000 g в течение 10 минут осадок растворяли в растворе, состоящем из 40 мкл реакционного буфера ASC и 10 мкл 6-кратного буфера для загрузки белка (TransGen, Пекин, Китай), а затем раствор гасили при комнатной температуре в течение 15 минут. мин., Затем кипятить 10 минут.Затем образцы белка подвергали вестерн-блоттингу с использованием первичных антител против ASC (Ванлейбио, Шэньян, Китай) в соотношении разбавлений 1:500.
Следуя ранее описанной процедуре [13], супернатанты клеточных культур собирали и определяли секрецию провоспалительного цитокина IL-1β с использованием набора ELISA для мышиного IL-1 Beta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Преобразуйте значения OD450nm в концентрации белка, используя стандартную кривую IL-1β.
Клетки, покрытые покровными стеклами, осторожно промывали 3 раза в теплом PBS, фиксировали в фиксаторе клеток тканей (Biosharp, Пекин, Китай) в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), в 0,1% Triton X-Permeabilize при 100 (разбавленном в PBS; Biosharp). ) в течение 20 минут при комнатной температуре и блокируют 5% бычьего сывороточного альбумина (в PBS) на 2 часа при комнатной температуре.Затем клетки инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами против ASC (разведение 1:100) или NLRP3 (разведение 1:100) соответственно и меченными Cy3 козьими анти-кроличьими IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , Сан-Франциско, Калифорния, США) или конъюгированные с FITC козьи антимышиные IgG (1:400; Earthox) в течение ночи при 37°C в темноте в течение 1 часа.Ядра окрашивали Hoechst 33258 (10 мкг/мл; UE, Сучжоу, Китай) в течение 5 минут и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus Corporation, Токио, Япония).
Мышей разделили на четыре группы (n=7 в каждой группе): (i) группа отрицательного контроля, обработанная PBS (только PBS; через зонд 100 мкл/мышь PBS с последующей ежедневной внутрибрюшинной инъекцией 100 мкл/мышь PBS через 3 часа)., непрерывно в течение 7 дней);(ii) группа отрицательного контроля, получавшая ингибитор MCC950 [27] (100 мкл/мышь через зонд PBS, через 3 часа, 10 мг/кг массы тела [BW] MCC950 [в PBS] вводили внутрибрюшинно ежедневно, продолжительность 7 дней);(iii) группа инфекции кистами G. duodenalis (1,5×106 цист/мышь через зонд, через 3 часа, 100 мкл/мышь PBS внутрибрюшинно, ежедневно в течение 7 дней);(iv) Группа лечения комбинированной инфекцией кисты G. duodenalis, группа лечения ингибитором MCC950 (1,5×106 цист/мышь через зонд, 10 мг/кг массы тела MCC950 внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней через 3 часа).Массу тела каждой мыши контролировали ежедневно, и всех мышей подвергали эвтаназии на 7-й день.Собранную двенадцатиперстную кишку (длиной 3 см) разрезали на мелкие кусочки в 1 мл PBS, цисты разрушали в течение ночи в PBS при 4°C и трофозоиты G. duodenalis.Свежую двенадцатиперстную кишку (длиной 1 см) выделяли для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E).
Мышей разделили на две группы: (i) контрольную группу MOCK и (ii) группу ингибитора MCC950.В каждой группе было по пять обработок (n = 7 на группу лечения): (i) группа отрицательного контроля, обработанная PBS (только PBS; 100 мкл/мышь PBS, внутримышечная (в/м) инъекция (передняя большеберцовая мышца) [28, 29] ;( ii) группа отрицательного контроля плазмиды pcDNA3.1(+) (100 мкг/мышиная ДНК, внутримышечная инъекция); (iii) группа положительного контроля при инфекции кисты G. duodenalis (1,5×106 цист/мышь, через зонд) (iv) a группа, получавшая плазмиду pcDNA3.1(+)-альфа-2 (100 мкг/мышиная ДНК, внутримышечная инъекция), и (v) группа, получавшая плазмиду pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 (100 мкг/мышь) ДНК, после 12 часов пассажа мыши в группе ингибитора MCC950 получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию MCC950 (10 мг/кг массы тела) в течение 7 дней, тогда как мыши в группе MOCK получали равный объем лечения PBS. Образцы крови были собирали из глазных яблок мышей и оставляли на ночь при 4°C. Образцы сыворотки выделяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) для определения уровней IL-1β.
Тридцать пять мышей были разделены на пять групп (n=7/группа).Группа 1 представляла собой группу отрицательного контроля, обработанную PBS: мыши получали 100 мкл PBS внутримышечно и через 3 дня через зонд.Группа 2 представляет собой группу положительного контроля, инфицированную кистами G. duodenalis: мышам вводили 100 мкл PBS, а через 3 дня внутрижелудочно вводили 1,5×106 цист/мышь.Третья группа – плазмидная иммунизация pcDNA3.1(+) в сочетании с контрольной группой при инфицировании кисты двенадцатиперстной кишки: мыши получали 100 мкг плазмидной ДНК pcDNA3.1(+)(в/м) перорально, 1,5×106 цист/мышь 3 на несколько дни.Группы 4 и 5 представляли собой рекомбинантную гиардиновую плазмиду pcDNA3.1(+)-альфа-2 или гиардиновую плазмиду pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 в сочетании с инфекцией цист G. duodenalis.Экспериментальная группа: мыши получали 100 мкг pcDNA3.ДНК 1(+)-гиардиновой плазмиды (в/м), затем через 3 дня через зонд вводили 1,5 × 106 цист/мышь.Массу тела каждой мыши контролировали после введения кисты G. duodenalis через трубку.Свежую двенадцатиперстную кишку собирали для измерения паразитарной нагрузки и анализа окрашивания HE.
Гистопатологические изменения анализировали согласно ранее опубликованной методике [30].Свежую двенадцатиперстную кишку фиксировали фиксатором клеток ткани, заливали в парафин, разрезали на срезы толщиной 4 мкм, окрашивали H&E и анализировали под световым микроскопом.Репрезентативные патологические изменения в семи срезах тканей семи независимых мышей оценивались патологом, не знающим о лечении, и были зафиксированы при 200-кратном увеличении.Длину ворсинок и глубину крипт измеряли в соответствии с ранее описанными методами.
Результаты in vitro и in vivo были получены в трех повторностях.Графики были созданы с использованием GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США).Различия между двумя группами анализировали с помощью t-критерия, а различия между ≥3 группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS (версия 22.0; SPSS IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США).Данные анализировали на однородность дисперсии с использованием теста Левена с последующим апостериорным тестом Бонферрони (B).Значимость выражается как P<0,05, P<0,01 и P<0,001 (незначимо [нс]) (P>0,05).
Наш предыдущий анализ протеомики GEV в Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) показал, что многие мишени могут быть вовлечены в активацию воспалительных сигнальных путей [13].Мы выбрали две многообещающие мишени, гиардины альфа-2 и альфа-7.3, амплифицировали эти молекулы и использовали их для создания эукариотического вектора экспрессии pcDNA3.1(+).После секвенирования рекомбинантные плазмиды, экспрессирующие гиардин pcDNA3.1(+)-альфа-2 и альфа-7.3, трансфицировали в первичные перитонеальные макрофаги мыши и идентифицировали сигнатурный белок воспаления каспазы-1 p20 (фрагмент активированной каспазы-1). как выяснение ключевых молекул, которые могут вызвать воспаление.Результаты показали, что гиардины альфа-2 и альфа-7,3 могут индуцировать экспрессию каспазы-1 p20, аналогично GEV.Никакого влияния на активацию каспазы-1 не было обнаружено в необработанном отрицательном контроле (только PBS) и плазмидном контроле pcDNA3.1(+) (рис. 1).
Измерение активации каспазы-1 p20 с помощью гиардинов pcDNA3.1(+)-альфа-2 и альфа-7.3.Рекомбинантные эукариотические экспрессирующие плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 и альфа-7.3 гиардины (над каждой дорожкой) трансфицировали в первичные перитонеальные макрофаги мыши, и через 24 часа собирали культуральные супернатанты.Вестерн-блоттинг использовали для измерения уровней экспрессии характерного белка воспалительной каспазы-1 p20.Группу лечения только PBS (дорожка C) и группу монотерапии pcDNA3.1(+) (дорожка pcDNA3.1) использовали в качестве отрицательного контроля, а группу лечения GEV использовали в качестве положительного контроля.Экспрессию рекомбинантного белка подтверждали путем обнаружения гистидиновой метки в каждом белке, и ожидаемыми белковыми полосами были альфа-2 гиардин (38,2 кДа) и альфа-7,3 гиардин (37,2 кДа).GEV, внеклеточные везикулы Giardia двенадцатиперстной кишки, pcDNA3.1(+), EcoRV-линеаризованный вектор, SUP, супернатант
Чтобы определить, индуцируют ли гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 экспрессию каспазы-1 p20 и играют ли роль в активации воспалительной реакции NLRP3 хозяина, гиардин pcDNA3.1(+)-альфа-2 и pcDNA3.1(+)-альфа Гиардин -7.3 трансфицировали в первичные перитонеальные макрофаги мыши рекомбинантной плазмидной ДНК и определяли уровни экспрессии, локализации и олигомеризации ключевых воспалительных белков NLRP3.В этом эксперименте GEV использовали в качестве группы положительного контроля, а группа без лечения (только PBS) или группа лечения трансфекцией pcDNA3.1(+) была отрицательной группой.Результаты показали, что, как и в группе GEV, рекомбинантная плазмидная ДНК гиардина pcDNA3.1(+)-альфа-2 и гиардина pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 приводила к усилению регуляции NLRP3, про-IL-1β и активация прокаспазы-1 и каспазы-1 (рис. 2а).Кроме того, оба гиардина индуцировали значительную секрецию IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; альфа-2 гиардин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007. ).;альфа-7,3 гиардин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (рис. 2б).Большинство белков ASC были мономерными в группе без лечения или в группе лечения, трансфицированной плазмидой pcDNA3.1(+), в отличие от pcDNA3.1(+)-альфа-2 или pcDNA3.1(+)-альфа-2. 7,3 жардина.Олигомеризация ASC произошла в рекомбинантной плазмидной ДНК группы или группы положительного контроля GEV, демонстрируя олигомерную форму (рис. 2c).Эти предварительные данные позволяют предположить, что альфа-2-гиардин и альфа-7,3-гиардин могут индуцировать активацию воспаления NLRP3.Последующие иммунофлуоресцентные исследования локализации ASC и NLRP3 показали, что в группе отрицательного контроля белок ASC был разбросан по цитоплазме и появлялся в виде точечного сигнала при стимуляции pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардином или pcDNA3.Группа 1(+)-альфа-7,3 гиардина или группа положительного контроля GEV (рис. 2d).В группах отрицательного контроля и обработанных плазмидой pcDNA 3.1 сигнал белка NLRP3 не был обнаружен, тогда как флуоресцентная сигнальная точка в ответ на гиардин pcDNA3.1(+)-альфа-2 или pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 был обнаружен..giardine обнаруживаются в цитоплазме или при стимуляции ВГЭ (рис. 2д).Эти данные также демонстрируют, что гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 G. duodenalis активируют воспалительную сому NLRP3 в первичных перитонеальных макрофагах мышей.
Гиардин pcDNA3.1(+)-альфа-2 и гиардин pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 активируют воспалительную сому NLRP3 в перитонеальных макрофагах мыши.Трансфецируйте рекомбинантные эукариотические экспрессирующие плазмиды pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардин и pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 гиардин в первичные мышиные перитонеальные макрофаги и клетки или соберите супернатант в течение 24 часов для анализа экспрессии и олигомеризации. , секреция.и локализация ключевых воспалительных белков.Группа, получавшая только PBS (C), и группа, получавшая одинарное лечение pcDNA3.1(+), использовались в качестве отрицательного контроля, а группа лечения GEV использовалась в качестве положительной группы.a Ключевые воспалительные белки NLRP3, включая NLRP3, про-IL-1β, прокаспазу-1 и p20-каспазу-1, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга.б Уровни секреции IL-1β в супернатантах определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).Различия между контрольной и экспериментальной группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на значительные различия между группами **P<0,01 и ***P<0,001.c Уровни олигомеризации ASC в гранулах определяли с помощью анализа перекрестных связей DSS, тогда как уровни ASC в клеточных лизатах использовали в качестве контроля нагрузки.г Визуализация локализации ISC с помощью иммунофлуоресценции.e Иммунофлуоресценцию использовали для визуализации локализации NLRP3.ASC — апоптотический пятнышкообразный белок;IL, интерлейкин;NLRP3, нуклеотидсвязывающий рецептор 3, подобный олигомеризации;нс, незначительно (P > 0,05)
И G. duodenalis, и GEV, которые он секретирует, активируют инфламмасому NLRP3 и регулируют воспалительные реакции хозяина in vitro.Таким образом, роль воспаления NLRP3 в патогенности G. duodenalis остается неясной.Чтобы исследовать эту проблему, мы разработали эксперимент между мышами, инфицированными кистой G. duodenalis, и мышами, инфицированными кистой G. duodenalis + лечение ингибитором MCC950, и сравнили экспрессию воспалительных NLRP3 при инфицировании кистой G. duodenalis.Подробная схема эксперимента представлена ​​на рис. 3а.Изменения массы тела мышей в различных группах лечения контролировали в течение 7 дней после заражения цистами, результаты представлены на рис. 3б.По сравнению с группой, получавшей чистый PBS, результаты показали, что (i) масса тела мышей, инфицированных кистой G. duodenalis, уменьшалась с 3-го по 7-й день после заражения;(ii) лечение ингибитором MCC950 не оказало существенного влияния на массу тела мышей..По сравнению с группой с одной инфекцией, МТ в группе с дуоденальной инфекцией, получавшей MCC950, снизилась в разной степени (День 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; День 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; День 3: дисперсионный анализ, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; День 4: дисперсионный анализ, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052; День 5: дисперсионный анализ, F; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; День 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175; День 7: ANOVA, F (3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Эти данные демонстрируют, что воспалительная сома NLRP3 защищает мышей от значительной потери веса на ранних стадиях (2-4 дня) инфекции двенадцатиперстной кишки.Затем мы стремились обнаружить трофозоиты G. duodenalis в лаваже двенадцатиперстной кишки, и результаты показаны на рисунке 3c.По сравнению с группой, зараженной кистой G. duodenalis, количество трофозоитов в двенадцатиперстной кишке значительно увеличилось после блокирования воспалительной сомы NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Ткани двенадцатиперстной кишки, окрашенные HE, показали по сравнению с отрицательным контролем, обработанным только PBS и MCC950: (i) инфекция кисты G. duodenalis привела к повреждению ворсинок двенадцатиперстной кишки (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0488). ) и атрофия крипт (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) двенадцатиперстная кишка мышей, инфицированных цистами G. duodenalis и обработанных ингибиторами MCC950.ворсинки двенадцатиперстной кишки были повреждены и мертвы (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) с атрофией и ветвлением крипт (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0481) (рис. 3г- е) .Эти результаты позволяют предположить, что воспаление NLRP3 играет роль в снижении патогенности G. duodenalis.
Роль воспаления NLRP3 в инфекции Giardia двенадцатиперстной кишки.Мышам вводили через зонд (внутривенно) дуоденококковые кисты, а затем вводили или не вводили MCC950 (внутрибрюшинно).В качестве контроля использовали отдельные группы лечения PBS или MCC950.Экспериментальная группа и схема лечения.b Массу тела мышей в каждой из различных групп лечения контролировали в течение 7 дней.Разницу между группой, получавшей инфекцию G. duodenalis, и группой, получавшей лечение инфекцией G. duodenalis + MCC950, анализировали с помощью t-критерия с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на существенные различия при *P<0,05, **P<0,01 или ***P<0,001.в Паразитарную нагрузку определяли путем подсчета количества трофозоитов в смывной жидкости двенадцатиперстной кишки.Разницу между группой, получавшей инфекцию G. duodenalis, и группой, получавшей лечение инфекцией G. duodenalis + MCC950, анализировали с помощью t-критерия с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на значительные различия при *P <0,05.d Результаты окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) при гистопатологии двенадцатиперстной кишки.Красные стрелки указывают на повреждение ворсинок, зеленые — на повреждение крипт.Масштабная линейка: 100 мкм.д, е Статистический анализ высоты ворсинок двенадцатиперстной кишки и высоты крипт мыши.Звездочки указывают на существенные различия при *P<0,05 и **P<0,01.Результаты взяты из 7 независимых биологических экспериментов.BW, масса тела;ig — внутрижелудочный путь доставки;ip — внутрибрюшинный путь доставки;нс – незначительно (P > 0,05);PBS, физиологический раствор с фосфатным буфером;WT, дикий тип
Секреция IL-1β является признаком активации воспаления.Чтобы определить, активируют ли гиардин альфа-2 G. duodenalis и гиардин альфа-7.3 воспалительную сому хозяина NLRP3 in vivo, мы использовали необработанных мышей дикого типа (фиктивная группа) и мышей с блокировкой воспаления NLRP3 (группа лечения с ингибированием MCC950).Подробная схема эксперимента представлена ​​на рис. 4а.Экспериментальные группы состояли из мышей, получавших PBS, лечение кист G. duodenalis через зонд, внутримышечную инъекцию pcDNA3.1 и внутримышечную инъекцию pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардина или pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардина.На 7-й день после внутримышечного введения рекомбинантной плазмиды собирали сыворотку и определяли уровень IL-1β в каждой группе.Как показано на рисунке 4b, в группе MOCK: (i) по сравнению с группой PBS обработка pcDNA3.1 не оказала существенного влияния на секрецию IL-1β (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), однако Секреция IL-β была значительно повышена в группе кист G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 гиардин и pcDNA3.1. Внутримышечная инъекция гиардина альфа-7,3 значительно повышала уровни IL-1β в сыворотке (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин индуцировал высокие уровни секреции IL-1β в группе внутримышечных инъекций pcDNA3.1-альфа-2 гиардин (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .По сравнению с каждой группой в группе лечения MCC950 и группе MOCK: (i) уровни секреции IL-1β в контрольной группе PBS и контрольной группе pcDNA3.1 снизились в определенной степени после блокирования ингибитора MCC950, но разница не была достоверный (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) после блокировки MCC950.Секреция IL-1β была значительно снижена в группе, инфицированной цистами G. duodenalis, группе гиардина pcDNA3.1-альфа-2 и группе гиардина pcDNA3.1-альфа-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120; pcDNA3.1-альфа-2 гиардин: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин: ANOVA, F(9, 58) ) = 3,540, Р = 0,0164).Эти результаты позволяют предположить, что гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 опосредуют активацию воспалительной сомы NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-гиардины активируют инфламмасому хозяина NLRP3 in vivo.Мышей иммунизировали (в/м) рекомбинантной эукариотической экспрессирующей плазмидой pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардин или pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 гиардин, а затем обрабатывали MCC950 (в/б; группа MCC950) или нет (фиктивная группа). ).Группу обработки плазмидой PBS или pcDNA3.1(+) использовали в качестве отрицательного контроля, группу обработки цистой G. duodenalis использовали в качестве положительного контроля.Экспериментальная группа и схема лечения.b Уровни IL-1β в сыворотке мышей измеряли на 7-й день с помощью анализа ELISA.Различия между группами в группе MOCK анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а различия между группой MOCK и группой MCC950 анализировали с использованием t-критерия программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на значительные различия между группами лечения в группе MOCK: *P<0,05 и ***P<0,001;знаки доллара ($) указывают на значительные различия между каждой группой в группе MOCK и группе MCC950 при P<0,05.Результаты семи независимых биологических экспериментов.i — внутримышечное введение, нс, незначительно (P > 0,05)
Чтобы исследовать влияние альфа-2 и альфа-7,3-гиардин-опосредованной активации воспаления хозяина NLRP3 на инфекционность G. duodenalis, мы использовали мышей WT C57BL/6 и вводили альфа-2-гиардин и альфа-7,3-гиардин.плазмиду вводили внутримышечно, через 3 дня через желудочный зонд кисты G. duodenalis, после чего за мышами наблюдали в течение 7 дней.Подробная схема эксперимента представлена ​​на рис. 5а.Массу тела каждой мыши измеряли каждый день, образцы свежей ткани двенадцатиперстной кишки собирали на 7-й день после введения через желудочный зонд, измеряли количество трофозоитов и наблюдали гистопатологические изменения.Как показано на рисунке 5b, с увеличением времени кормления масса тела мышей в каждой группе постепенно увеличивалась.МТ мышей начинал снижаться на 3-и сутки после внутрижелудочного введения цист G. duodenalis, а затем постепенно повышался.Активация воспаления NLRP3, индуцированная внутримышечной инъекцией гиардина альфа-2 и гиардина альфа7.3, значительно замедляла потерю веса у мышей (День 1: гиардин pcDNA3.1-альфа-2, ANOVA, F (4, 30) = 1,399, P = 0,9754 День 1: pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 День 2: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; День 2: pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; День 3: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F( 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 День 3: pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 День 4: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, День 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, День 5: pcDNA3.1-alpha - 2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 День 5: pcDNA3.1-альфа -7,3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 День 6: pcDNA3 .1 - альфа-2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, День 6: pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;День 7: pcDNA3.1-альфа-2 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 День 7: pcDNA3.1-альфа-7.3 гиардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Паразитарную нагрузку оценивали в двенадцатиперстной кишке (рис. 5в).По сравнению с необработанным положительным контролем и группой, которой вводили пустой вектор pcDNA3.1, количество трофозоитов G. duodenalis было значительно снижено в группах, которым вводили α-2 гиардин и α-7,3 гиардин (pcDNA3.1-альфа). -2 гиардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Кроме того, гиардин альфа-7,3 оказывал более высокий защитный эффект у мышей, чем гиардин альфа-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Результаты окрашивания HE представлены на рис.5д–е.У мышей, которым инъецировали гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7,3, наблюдалось меньшее количество поражений тканей двенадцатиперстной кишки, проявляющихся повреждением ворсинок, по сравнению с мышами, которым инъецировали G. duodenalis, и мышами, которым инъецировали G. duodenalis в сочетании с пустым вектором pcDNA3.1 Увеличение.(гиардин pcDNA3.1-альфа-2: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 или P = 0,0068; гиардин pcDNA3.1-альфа-7.3: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 или P = 0,0055) и снижение атрофии крипт (pcDNA3.1-альфа-2 гиардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 или P = 0,0158; pcDNA3.1-альфа-7,3 гиардин: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 или P = 0,0191).Эти результаты позволяют предположить, что альфа-2-гиардин и альфа-7,3-гиардин снижают инфекционность G. duodenalis путем активации воспалительной сомы NLRP3 in vivo.
Роль pcDNA3.1(+)-гиардинов при инфекции G. duodenalis.Мышей иммунизировали (IM) рекомбинантными эукариотическими экспрессирующими плазмидами pcDNA3.1(+)-альфа-2 гиардина или pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 гиардина, а затем заражали цистами G. duodenalis (ig).Группу PBS и группу лечения pcDNA3.1(+) + кисты двенадцатиперстной кишки использовали в качестве групп отрицательного контроля, а группу лечения кисты двенадцатиперстной кишки использовали в качестве группы положительного контроля.Экспериментальная группа и схема лечения.b МТ мышей в каждой из различных групп лечения контролировали в течение 7 дней после заражения.Звездочки указывают на значительные различия между группами в группе G. duodenalis и группе гиардина pcDNA3.1(+)-альфа-2, *P <0,05, **P <0,01 и ***P <0,001;знак доллара ($) указывает на значительную разницу между каждой группой G. duodenalis и группой pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 жардина, $$P<0,01 и $$$P<0,001.в Паразитарную нагрузку определяли путем подсчета количества трофозоитов в 1 мл дуоденального смыва из двенадцатиперстной кишки (длиной 3 см) и выражали в количестве паразитов на см двенадцатиперстной кишки.Различия между группой инфекции G. duodenalis, группой гиардина pcDNA3.1(+)-альфа-2 и группой гиардина pcDNA3.1(+)-альфа-7.3 анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на значительные различия при **P<0,01 и ***P<0,001.г Гистопатологические изменения двенадцатиперстной кишки.Красные стрелки указывают на повреждение ворсинок, зеленые — на повреждение крипт.Масштабная линейка: 100 мкм.д, е Статистический анализ высоты ворсинок двенадцатиперстной кишки мышей (д) и высоты крипт (е).Различия между группами на рисунке 1d были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0.Звездочки указывают на существенные различия при *P<0,05 и **P<0,01.Результаты семи независимых биологических экспериментов.нс, незначительно (P > 0,05)
Giardia duodenum — хорошо известный кишечный паразит человека и других млекопитающих, вызывающий лямблиоз.В 2004 году он был включен в Инициативу ВОЗ по забытым заболеваниям из-за его высокой распространенности в течение 6 лет, особенно в сообществах с низким социально-экономическим статусом [32].Врожденная иммунная система играет решающую роль в иммунном ответе на инфекцию G. duodenalis.Сообщалось, что мышиные макрофаги поглощают и убивают G. duodenalis, высвобождая внеклеточные ловушки [33].Наши предыдущие исследования показали, что G. duodenalis, неинвазивный внеклеточный паразит, активирует воспалительные сигнальные пути p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 и NLRP3 в макрофагах мыши, чтобы регулировать воспалительные реакции хозяина, а высвобождение GEV может усиливать этот процесс.13], 24].Однако точные PAMP, участвующие в воспалении, регулируемом NLRP3-воспалением при GEV, и роль воспаления NLRP3 в лямблиозе еще предстоит выяснить.Чтобы пролить свет на эти два вопроса, мы провели данное исследование.
Инфламмасома NLRP3 расположена в цитоплазме иммунных клеток и может активироваться различными частицами, такими как кристаллы мочевой кислоты, токсины, бактерии, вирусы и паразиты.В бактериальных исследованиях токсины были идентифицированы как ключевые PAMP, которые активируют воспалительные сенсоры, приводя к воспалению и гибели клеток [34].Некоторые структурно разнообразные токсины, такие как гемолизин из Staphylococcus aureus [35] и Escherichia coli [36], гемолизин BL (HBL) из энтеротоксина (NHE) [37], индуцируют активацию воспаления NLRP3.Вирусные исследования показали, что белки вирулентности, такие как белок оболочки (E) SARS-COV-2 [38] и белок NS5 вируса Зика [39], являются важными PAMP, распознаваемыми рецептором NLRP3.В исследованиях паразитов сообщалось, что многие паразиты, такие как Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] и Leishmania [42], связаны с активацией воспалительных сом хозяина.Белки плотных гранул GRA35, GRA42 и GRA43, связанные с вирулентностью Toxoplasma gondii, необходимы для индукции пироптоза в макрофагах крыс Льюис [43].Кроме того, некоторые исследования Leishmania были сосредоточены на отдельных молекулах, участвующих в воспалении NLRP3, таких как липофосфогликан мембраны паразита [44] или металлопротеаза цинка [45].Было показано, что среди аннексиноподобного семейства генов альфа-гиардина альфа-1-гиардин является потенциальным кандидатом на вакцину, обеспечивающую защиту от G. duodenalis на мышиной модели [18].В нашем исследовании мы выбрали факторы вирулентности лямблий G. duodenalis альфа-2 и альфа-7,3, которые уникальны для лямблий, но о которых сообщается относительно меньше.Эти два целевых гена были клонированы в вектор эукариотической системы экспрессии pcDNA3.1(+) для анализа активации воспаления.
В нашей мышиной модели расщепленные фрагменты каспазы служат маркерами активации воспаления.При стимуляции NLRP3 взаимодействует с ASC, рекрутирует прокаспазы и генерирует активные каспазы, которые расщепляют про-IL-1β и про-IL-18 до зрелых IL-1β и IL-18 соответственно -18.Воспалительные каспазы (каспазы-1, -4, -5 и -11) представляют собой консервативное семейство цистеиновых протеаз, которые имеют решающее значение для врожденной защиты и участвуют в воспалении и запрограммированной гибели клеток [46].Каспаза-1 активируется каноническими инфламмасомами [47], тогда как каспазы-4, -5 и -11 расщепляются при образовании атипичных воспалений [48].В этом исследовании мы использовали перитонеальные макрофаги мыши в качестве модели и исследовали расщепляемую каспазой-1 p20 каспаза-1 каспазу-1 в качестве маркера активации воспаления NLRP3 хозяина в исследованиях инфекции G. duodenalis.Результаты показали, что многие альфа-гиардины ответственны за типичную активацию воспаления, что согласуется с открытием ключевых молекул вирулентности, участвующих в бактериях и вирусах.Однако наше исследование является лишь предварительным скринингом, и существуют другие молекулы, которые могут активировать неклассические воспалительные процессы, поскольку наше предыдущее исследование выявило как классические, так и неклассические воспалительные процессы при инфекции G. duodenalis [13].Чтобы дополнительно определить, связана ли сгенерированная каспаза-1 p20 с воспалительной сомой NLRP3, мы трансфицировали гиардины альфа-2 и альфа-7.3 в перитонеальные макрофаги мыши, чтобы определить уровни экспрессии белка ключевых молекул и уровни олигомеризации ASC, подтвердив, что оба α-гиардина активируются. воспалительная NLRP3.Наши результаты немного отличаются от результатов Манко-Приходы и др., которые сообщили, что стимуляция клеток Caco-2 только штаммами EPEC G. muris или E. coli может увеличить интенсивность флуоресценции NLRP3, ASC и каспазы-1. хотя и незначительно, в то время как костимуляция G. muris и E. coli повышала уровни трех белков [49].Это несоответствие может быть связано с различиями в выборе видов лямблий, клеточных линий и первичных клеток.Мы также провели анализы in vivo с использованием MCC950 на 5-недельных самках мышей WT C57BL/6, которые более восприимчивы к G. duodenalis.MCC950 представляет собой мощный и селективный низкомолекулярный ингибитор NLRP3, который блокирует каноническую и неканоническую активацию NLRP3 в наномолярных концентрациях.MCC950 ингибирует активацию NLRP3, но не влияет на активацию воспалительных путей AIM2, NLRC4 и NLRP1 или сигнальных путей TLR [27].MCC950 блокирует активацию NLRP3, но не ингибирует инициацию NLRP3, отток K+, приток Ca2+ или взаимодействие между NLRP3 и ASC;вместо этого он ингибирует активацию воспаления NLRP3, блокируя олигомеризацию ASC [27].Поэтому мы использовали MCC950 в исследовании in vivo, чтобы определить роль воспаления NLRP3 после инъекции гиардина.Активированная каспаза-1 p10 расщепляет провоспалительные цитокины про-IL-1β и про-IL-18 до зрелых IL-1β и IL-18 [50].В этом исследовании уровни IL-1β в сыворотке у мышей, получавших гиардин, с MCC950 или без него использовались в качестве индикатора того, активирована ли воспалительная сома NLRP3.Как и ожидалось, лечение MCC950 значительно снижало уровни IL-1β в сыворотке.Эти данные ясно демонстрируют, что гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 G. duodenalis способны активировать воспалительную сому мыши NLRP3.
Значительные данные, накопленные за последнее десятилетие, продемонстрировали, что IL-17A является главным регулятором иммунитета против G. muris, индуцируя передачу сигналов IL-17RA, продуцируя антимикробные пептиды и регулируя активацию комплемента [51].Однако инфекция лямблий чаще встречается у молодых людей, и сообщалось, что инфекция лямблий у молодых мышей не активирует реакцию IL-17A для проявления защитного эффекта [52], что побуждает исследователей искать другие иммуномодулирующие лямблии.Механизмы заражения гельминтами.Авторы недавнего исследования сообщили, что G. muris может активировать инфламмасому NLRP3 EPEC E. coli, что способствует выработке антимикробных пептидов и снижает ее способность к прикреплению и количество трофозоитов в кишечном тракте, тем самым уменьшая тяжесть поражения толстой кишки. заболевания, вызываемые бациллами [49].Инфламмасома NLRP3 участвует в развитии различных заболеваний.Исследования показали, что Pseudomonas aeruginosa запускает аутофагию в макрофагах, чтобы избежать гибели клеток, и этот процесс зависит от активации воспалительной NLRP3 [53].Для N. caninum активация воспалительной сомы NLRP3, опосредованная активными формами кислорода, ограничивает ее репликацию в хозяине, что делает ее потенциальной терапевтической мишенью [9].Было обнаружено, что Paracoccidioides brasiliensis индуцирует активацию воспаления NLRP3 в дендритных клетках костного мозга мышей, что приводит к высвобождению воспалительного цитокина IL-1β, который играет решающую роль в защите хозяина [10].Несколько видов Leishmania, включая L. amazonensis, L. major, L. braziliensis и L. infantum chagasi, активируют NLRP3 и ASC-зависимую каспазу-1 в макрофагах, а также инфекцию Leishmania.Репликация паразита усиливается у мышей, дефицитных по гену NLRP3/ASC/каспаза-1 [11].Замбони и др.Сообщалось, что инфекция Leishmania вызывает активацию воспаления NLRP3 в макрофагах, что ограничивает внутриклеточную репликацию паразита.Таким образом, Leishmania может ингибировать активацию NLRP3 в качестве стратегии избегания.В исследованиях in vivo воспаление NLRP3 способствовало элиминации Leishmania, но не влияло на ткани [54].И наоборот, в исследованиях гельминтозов активация воспаления NLRP3 подавляла защитный иммунитет хозяина против желудочно-кишечных гельминтозов [12].Шигеллы – одна из основных бактерий, вызывающих диарею во всем мире.Эти бактерии могут индуцировать выработку IL-1β посредством опосредованного рецептором P2X7 оттока K+, активных форм кислорода, лизосомального закисления и повреждения митохондрий.Инфламмасома NLRP3 отрицательно регулирует фагоцитоз и бактерицидную активность макрофагов против шигелл [55].Исследования плазмодия показали, что мыши с дефицитом AIM2, NLRP3 или каспазы-1, инфицированные плазмодием, производят высокие уровни интерферона 1 типа и более устойчивы к инфекции плазмодия [56].Однако роль гиардина альфа-2 и гиардина альфа-7.3 в индукции патогенной активации воспаления NLRP3 у мышей неясна.
В этом исследовании ингибирование воспаления NLRP3 с помощью MCC950 снижало массу тела и увеличивало количество трофозоитов в жидкости кишечного лаважа у мышей, что приводило к более тяжелым патологическим изменениям в ткани двенадцатиперстной кишки.Гиардин альфа-2 и гиардин альфа-7.3 активируют воспалительную сому NLRP3 мыши-хозяина, увеличивают массу тела мыши, уменьшают количество трофозоитов в жидкости кишечного лаважа и облегчают патологические поражения двенадцатиперстной кишки.Эти результаты позволяют предположить, что G. duodenalis может активировать воспаление хозяина NLRP3 через альфа-2-гиардин и альфа-7,3-гиардин, снижая патогенность G. duodenalis у мышей.
В совокупности наши результаты показывают, что гиардины альфа-2 и альфа-7.3 индуцируют активацию воспалительной сомы хозяина NLRP3 и снижают инфекционность G. duodenalis у мышей.Следовательно, эти молекулы являются перспективными мишенями для профилактики лямблиоза.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Лян АКС, Лян ААМ, Хуан АХК, Серги КМ, Кам ДжКМ.Лямблиоз: обзор.Недавно выяснилось, что у Пэт Инфламм аллергия на лекарства.2019;13:134–43.
Эскобедо А.А., Цимерман С. Лямблиоз: обзор фармакотерапии.Экспертное мнение фармацевта.2007 г.;8: 1885–902.
Тянь Хуафэн, Чэнь Бинь, Вэнь Цзяньфэн.Лямблиоз, лекарственная устойчивость и открытие новых мишеней.Заражает цели препарата Disord.2010;10:295–302.
Ван Z, Чжан X, Сяо И, Чжан W, Ву X, Цинь Т и др. Воспалительные и воспалительные заболевания NLRP3.Оксид Мед Селл Лонгев.2020;2020:4063562.
Чен Г.И., Нуньес Г. Роль инфламмасомы в воспалении кишечника и раке.Гастроэнтерология.2011 г.;141: 1986–99.
Пеллегрини С., Антониоли Л., Лопес-Кастехон Г., Бландиззи С., Форнаи М. Каноническая и атипичная активация воспаления NLRP3 на стыке иммунной толерантности и воспаления кишечника.преиммунный.2017;8:36.
Ли Л., Ван XC, Гонг П.Т., Чжан Н., Чжан Х., Ли С. и др.АФК-опосредованная активация воспаления NLRP3 участвует в ответе на инфекцию N. caninum.Вектор паразитов.2020;13:449.