Благодарим вас за посещение Nature.com.Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Генные векторы для лечения муковисцидоза легких должны быть нацелены на проводящие дыхательные пути, поскольку периферическая трансдукция легких не имеет терапевтического эффекта.Эффективность вирусной трансдукции напрямую связана со временем пребывания носителя.Однако жидкости для доставки, такие как носители генов, естественным образом диффундируют в альвеолы ​​во время ингаляции, а терапевтические частицы любой формы быстро удаляются посредством мукоцилиарного транспорта.Продление времени пребывания носителей генов в дыхательных путях важно, но трудно достижимо.Магнитные частицы, сопряженные с носителем, которые можно направить на поверхность дыхательных путей, могут улучшить региональное нацеливание.Из-за проблем с визуализацией in vivo поведение таких маленьких магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля плохо изучено.Целью данного исследования было использование синхротронной визуализации для визуализации in vivo движения ряда магнитных частиц в трахее наркотизированных крыс с целью изучения динамики и закономерностей поведения одиночных и объемных частиц in vivo.Затем мы также оценили, повысит ли доставка лентивирусных магнитных частиц в присутствии магнитного поля эффективность трансдукции в трахее крысы.Синхротронная рентгеновская визуализация показывает поведение магнитных частиц в стационарных и движущихся магнитных полях in vitro и in vivo.Частицы нелегко перетащить по поверхности живых дыхательных путей с помощью магнитов, но во время транспортировки отложения концентрируются в поле зрения, где магнитное поле наиболее сильное.Эффективность трансдукции также увеличивалась в шесть раз, когда лентивирусные магнитные частицы доставлялись в присутствии магнитного поля.В совокупности эти результаты позволяют предположить, что лентивирусные магнитные частицы и магнитные поля могут быть ценными подходами для улучшения нацеливания генного вектора и уровня трансдукции в проводящих дыхательных путях in vivo.
Муковисцидоз (МВ) вызван изменениями в одном гене, называемом регулятором трансмембранной проводимости МВ (CFTR).Белок CFTR представляет собой ионный канал, который присутствует во многих эпителиальных клетках по всему организму, включая дыхательные пути, основной участок патогенеза муковисцидоза.Дефекты CFTR приводят к аномальному транспорту воды, обезвоживанию поверхности дыхательных путей и уменьшению глубины поверхностного слоя жидкости (ASL) дыхательных путей.Это также ухудшает способность системы мукоцилиарного транспорта (МСТ) очищать дыхательные пути от вдыхаемых частиц и патогенов.Наша цель — разработать лентивирусную (LV) генную терапию для доставки правильной копии гена CFTR и улучшения ASL, MCT и здоровья легких, а также продолжить разработку новых технологий, которые могут измерять эти параметры in vivo1.
Векторы LV являются одними из ведущих кандидатов для генной терапии муковисцидоза, главным образом потому, что они могут навсегда интегрировать терапевтический ген в базальные клетки дыхательных путей (стволовые клетки дыхательных путей).Это важно, поскольку они могут восстанавливать нормальную гидратацию и клиренс слизи путем дифференцировки в функциональные генно-корректированные клетки поверхности дыхательных путей, связанные с муковисцидозом, что приводит к пожизненным преимуществам.Векторы ЛЖ должны быть направлены против проводящих дыхательных путей, поскольку именно здесь начинается поражение легких при МВ.Доставка вектора глубже в легкие может привести к альвеолярной трансдукции, но это не оказывает терапевтического эффекта при муковисцидозе.Однако жидкости, такие как носители генов, естественным образом мигрируют в альвеолы ​​при вдыхании после родов3,4, а терапевтические частицы быстро выбрасываются в полость рта под действием МСТ.Эффективность трансдукции ЛЖ напрямую связана с продолжительностью времени, в течение которого вектор остается близко к клеткам-мишеням, чтобы обеспечить клеточное поглощение – «время пребывания» 5, которое легко сокращается за счет типичного регионального потока воздуха, а также скоординированного поглощения слизи и частиц МСТ.При муковисцидозе способность продлевать время пребывания ЛЖ в дыхательных путях важна для достижения высокого уровня трансдукции в этой области, но до сих пор это было непросто.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы предлагаем, чтобы магнитные частицы низкого напряжения (МП) могли помочь двумя взаимодополняющими способами.Во-первых, их можно направлять с помощью магнита на поверхность дыхательных путей, чтобы улучшить нацеливание и помочь частицам-носителям генов оказаться в нужном участке дыхательных путей;и ASL) перемещаются в клеточный слой 6. МП широко используются в качестве средств целевой доставки лекарств, когда они связываются с антителами, химиотерапевтическими препаратами или другими небольшими молекулами, которые прикрепляются к клеточным мембранам или связываются с соответствующими рецепторами клеточной поверхности и накапливаются в участках опухоли в наличие статического электричества.Магнитные поля для лечения рака 7. Другие «гипертермические» методы направлены на уничтожение опухолевых клеток путем нагревания МП под воздействием осциллирующих магнитных полей.Принцип магнитной трансфекции, при котором магнитное поле используется в качестве агента трансфекции для усиления переноса ДНК в клетки, обычно используется in vitro с использованием ряда невирусных и вирусных генных векторов для трудно трансдуцируемых клеточных линий. ..Установлена ​​эффективность магнитотрансфекции ЛЖ с доставкой МП ЛЖ in vitro в линию клеток бронхиального эпителия человека в присутствии статического магнитного поля, повышающая эффективность трансдукции в 186 раз по сравнению с использованием только вектора ЛЖ.LV MT также применялся к модели муковисцидоза in vitro, где магнитная трансфекция увеличивала трансдукцию LV в культурах на границе раздела воздух-жидкость в 20 раз при наличии мокроты при муковисцидозе10.Однако магнитотрансфекции органов in vivo уделялось относительно мало внимания и оценивалось лишь в нескольких исследованиях на животных11,12,13,14,15, особенно в легких16,17.Однако возможности магнитной трансфекции в терапии легких при муковисцидозе очевидны.Тан и др.(2020) заявили, что «проверочное исследование эффективной доставки магнитных наночастиц в легкие проложит путь для будущих стратегий ингаляции CFTR для улучшения клинических результатов у пациентов с муковисцидозом»6.
Поведение малых магнитных частиц на поверхности дыхательных путей в присутствии приложенного магнитного поля сложно визуализировать и изучать, в связи с чем оно мало изучено.В других исследованиях мы разработали метод рентгеновской визуализации с фазовым контрастом на основе синхротронного распространения (PB-PCXI) для неинвазивной визуализации и количественной оценки мельчайших in vivo изменений глубины ASL18 и поведения MCT19,20 для прямого измерения гидратации поверхности газовых каналов. и используется в качестве раннего индикатора эффективности лечения.Кроме того, в нашем методе оценки MCT используются частицы диаметром 10–35 мкм, состоящие из оксида алюминия или стекла с высоким показателем преломления, в качестве маркеров MCT, видимых с помощью PB-PCXI21.Оба метода подходят для визуализации различных типов частиц, включая МП.
Благодаря высокому пространственному и временному разрешению наши анализы ASL и MCT на основе PB-PCXI хорошо подходят для изучения динамики и моделей поведения одиночных и объемных частиц in vivo, чтобы помочь нам понять и оптимизировать методы доставки генов MP.Подход, который мы используем здесь, основан на наших исследованиях с использованием лучевой линии SPring-8 BL20B2, в которых мы визуализировали движение жидкости после доставки дозы фиктивного вектора в носовые и легочные дыхательные пути мышей, чтобы помочь объяснить наблюдаемые нами гетерогенные закономерности экспрессии генов. в нашем ген.исследования на животных с несущей дозой 3,4 .
Целью данного исследования было использование синхротрона PB-PCXI для визуализации in vivo движений ряда МП в трахее живых крыс.Эти исследования изображений PB-PCXI были разработаны для проверки серии MP, силы магнитного поля и местоположения, чтобы определить их влияние на движение MP.Мы предполагали, что внешнее магнитное поле поможет доставленному МЖ оставаться или перемещаться в область цели.Эти исследования также позволили нам определить конфигурации магнитов, которые максимизируют количество частиц, остающихся в трахее после осаждения.Во второй серии исследований мы стремились использовать эту оптимальную конфигурацию, чтобы продемонстрировать характер трансдукции, возникающий в результате доставки LV-MP in vivo в дыхательные пути крыс, предполагая, что доставка LV-MP в контексте нацеливания на дыхательные пути приведет к в повышении эффективности трансдукции ЛЖ..
Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Университетом Аделаиды (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетом по этике синхротронных животных SPring-8.Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Все рентгеновские изображения были получены на канале BL20XU синхротрона SPring-8 в Японии с использованием установки, аналогичной описанной ранее21,22.Вкратце, экспериментальный ящик располагался в 245 м от накопителя синхротрона.Расстояние от образца до детектора 0,6 м используется для исследований изображений частиц и 0,3 м для исследований изображений in vivo для создания эффектов фазового контраста.Использовался монохроматический пучок с энергией 25 кэВ.Изображения были получены с помощью рентгеновского преобразователя высокого разрешения (SPring-8 BM3), соединенного с детектором sCMOS.Преобразователь преобразует рентгеновские лучи в видимый свет с помощью сцинтиллятора толщиной 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12), который затем направляется на датчик sCMOS с помощью объектива микроскопа ×10 (NA 0,3).Детектор sCMOS представлял собой Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япония) с размером матрицы 2048 × 2048 пикселей и размером необработанных пикселей 6,5 × 6,5 мкм.Эта настройка обеспечивает эффективный размер изотропного пикселя 0,51 мкм и поле зрения примерно 1,1 мм × 1,1 мм.Продолжительность воздействия 100 мс была выбрана для максимизации соотношения сигнал/шум магнитных частиц внутри и снаружи дыхательных путей и минимизации артефактов движения, вызванных дыханием.Для исследований in vivo на пути прохождения рентгеновских лучей был установлен быстрый рентгеновский затвор, чтобы ограничить дозу облучения путем блокировки рентгеновского луча между экспозициями.
Среда LV не использовалась ни в каких исследованиях визуализации SPring-8 PB-PCXI, поскольку камера визуализации BL20XU не сертифицирована по уровню биобезопасности 2.Вместо этого мы выбрали ряд хорошо изученных МП от двух коммерческих поставщиков, охватывающих ряд размеров, материалов, концентраций железа и областей применения — сначала для того, чтобы понять, как магнитные поля влияют на движение МП в стеклянных капиллярах, а затем в живые дыхательные пути.поверхность.Размер МП варьируется от 0,25 до 18 мкм и изготавливается из различных материалов (см. табл. 1), но состав каждого образца, в том числе размер магнитных частиц в МП, неизвестен.Основываясь на наших обширных исследованиях МКТ 19, 20, 21, 23, 24, мы ожидаем, что МП размером до 5 мкм можно увидеть на поверхности дыхательных путей трахеи, например, путем вычитания последовательных кадров, чтобы увидеть улучшенную видимость движения МП.Одиночный MP размером 0,25 мкм меньше разрешения устройства визуализации, но ожидается, что PB-PCXI обнаружит их объемный контраст и движение поверхностной жидкости, на которую они наносятся после осаждения.
Выборки для каждого МП в таблице.1 готовили в стеклянных капиллярах емкостью 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, США) с внутренним диаметром 0,63 мм.Корпускулярные частицы доступны в воде, а частицы CombiMag доступны в фирменной жидкости производителя.Каждая пробирка наполовину заполняется жидкостью (приблизительно 11 мкл) и помещается на держатель образца (см. рисунок 1).Стеклянные капилляры располагались горизонтально на столике в камере визуализации соответственно и располагались по краям жидкости.Магнит в никелевой оболочке диаметром 19 мм (длиной 28 мм), изготовленный из редкоземельных металлов, неодима, железа и бора (NdFeB) (N35, каталожный номер LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) с остаточной намагниченностью 1,17 Тл, был прикреплен к отдельная таблица переноса для удаленного изменения положения во время рендеринга.Рентгеновская визуализация начинается, когда магнит располагается примерно на 30 мм над образцом, и изображения получаются со скоростью 4 кадра в секунду.Во время визуализации магнит подносили близко к стеклянной капиллярной трубке (на расстоянии около 1 мм), а затем перемещали вдоль трубки для оценки влияния напряженности поля и положения.
Установка для визуализации in vitro, содержащая образцы МП в стеклянных капиллярах на этапе трансляции образца xy.Путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией.
После того как была установлена ​​видимость MPs in vitro, подмножество их тестировали in vivo на самках белых крыс Wistar дикого типа (возраст ~12 недель, ~200 г).Медетомидин 0,24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Япония), мидазолам 3,2 мг/кг (Дормикум®, Астеллас Фарма, Япония) и буторфанол 4 мг/кг (Веторфале®, Мэйджи Сейка).Крыс наркотизировали смесью Pharma (Япония) путем внутрибрюшинной инъекции.После анестезии их готовили к визуализации путем удаления шерсти вокруг трахеи, введения эндотрахеальной трубки (ET; внутривенная канюля 16 Ga, Terumo BCT) и иммобилизации в положении лежа на изготовленной на заказ пластине для визуализации, содержащей термомешок. для поддержания температуры тела.22. Затем пластину для визуализации прикрепили к предметному столику в блоке для визуализации под небольшим углом, чтобы выровнять трахею по горизонтали на рентгеновском изображении, как показано на рисунке 2а.
(а) Установка визуализации in vivo в блоке визуализации SPring-8, путь рентгеновского луча отмечен красной пунктирной линией.(б, в) Локализация трахеального магнита выполнялась удаленно с использованием двух ортогонально установленных IP-камер.В левой части изображения на экране вы можете видеть проволочную петлю, удерживающую голову, и канюлю доставки, установленную внутри эндотрахеальной трубки.
Систему шприцевого насоса с дистанционным управлением (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида) с использованием стеклянного шприца емкостью 100 мкл подключали к трубке PE10 (наружный диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм) с помощью иглы 30 Ga.Пометьте трубку, чтобы убедиться, что кончик находится в правильном положении в трахее при введении эндотрахеальной трубки.С помощью микронасоса поршень шприца удаляли и кончик пробирки погружали в доставляемый образец MP.Затем загруженную доставочную трубку вставили в эндотрахеальную трубку, поместив ее кончик в самую сильную часть ожидаемого нами приложенного магнитного поля.Получение изображения контролировалось с помощью детектора дыхания, подключенного к нашему блоку синхронизации на базе Arduino, а все сигналы (например, температура, дыхание, открытие/закрытие затвора и получение изображения) записывались с использованием Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия). 22 При визуализации Когда корпус был недоступен, две IP-камеры (Panasonic BB-SC382) располагались примерно под углом 90° друг к другу и использовались для контроля положения магнита относительно трахеи во время визуализации (рис. 2б, в).Чтобы свести к минимуму артефакты движения, во время плато терминального дыхательного потока получали одно изображение на каждый вдох.
Магнит прикреплен ко второму столику, который может быть расположен удаленно снаружи формирователя изображения.Были протестированы различные положения и конфигурации магнита, в том числе: размещение под углом примерно 30° над трахеей (конфигурации показаны на рисунках 2а и 3а);один магнит над животным, другой внизу, с полюсами, установленными для притяжения (рис. 3б)., один магнит над животным и один внизу, с полюсами, установленными для отталкивания (рис. 3c), и один магнит сверху и перпендикулярно трахеи (рис. 3d).После настройки животного и магнита и загрузки тестируемого MP в шприцевой насос доставьте дозу 50 мкл со скоростью 4 мкл/сек после получения изображений.Затем магнит перемещают вперед и назад вдоль или поперек трахеи, продолжая получать изображения.
Конфигурация магнита для визуализации in vivo (а) один магнит над трахеей под углом примерно 30°, (б) два магнита, настроенные на притяжение, (в) два магнита, настроенные на отталкивание, (г) один магнит над трахеей и перпендикулярно ей трахея.Наблюдатель смотрел вниз ото рта к легким через трахею, и рентгеновский луч проходил через левую сторону крысы и выходил из правой стороны.Магнит перемещают либо по длине дыхательных путей, либо влево и вправо над трахеей в направлении рентгеновского луча.
Мы также стремились определить видимость и поведение частиц в дыхательных путях при отсутствии смешения дыхания и частоты сердечных сокращений.Поэтому в конце периода визуализации животных гуманно умерщвляли из-за передозировки пентобарбитала (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, США; ~65 мг/кг внутрибрюшинно).Некоторых животных оставляли на платформе визуализации, и после прекращения дыхания и сердцебиения процесс визуализации повторяли, добавляя дополнительную дозу МП, если на поверхности дыхательных путей не было видно МП.
Полученные изображения были скорректированы на плоское и темное поле, а затем собраны в фильм (20 кадров в секунду; 15–25 × нормальная скорость в зависимости от частоты дыхания) с использованием специального сценария, написанного на MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Все исследования по доставке вектора гена LV проводились в Центре исследований лабораторных животных Университета Аделаиды и были направлены на использование результатов эксперимента SPring-8 для оценки того, может ли доставка LV-MP в присутствии магнитного поля улучшить перенос генов in vivo. .Для оценки воздействия МП и магнитного поля обрабатывали две группы животных: одной группе вводили МП ЛЖ с размещением магнита, а другой группе вводили контрольной группе МП ЛЖ без магнита.
Векторы генов LV были созданы с использованием ранее описанных методов 25, 26 .Вектор LacZ экспрессирует локализованный в ядре ген бета-галактозидазы, управляемый конститутивным промотором MPSV (LV-LacZ), который производит синий продукт реакции в трансдуцированных клетках, видимый на лицевой стороне и срезах легочной ткани.Титрование проводили в клеточных культурах путем ручного подсчета количества LacZ-положительных клеток с использованием гемоцитометра для расчета титра в ТЕ/мл.Носители криоконсервируют при -80°C, размораживают перед использованием и связывают с CombiMag путем смешивания 1:1 и инкубации на льду в течение как минимум 30 минут перед доставкой.
Нормальные крысы Sprague Dawley (n = 3/группа, ~2-3 внутрибрюшинно анестезированные смесью 0,4 мг/кг медетомидина (Domitor, Ilium, Австралия) и 60 мг/кг кетамина (Ilium, Австралия) в возрасте 1 месяца) внутрибрюшинно ) инъекция и нехирургическая пероральная канюляция внутривенной канюлей 16 Ga.Чтобы гарантировать, что ткань дыхательных путей трахеи получает трансдукцию ЛЖ, ее кондиционировали с использованием ранее описанного нами протокола механического воздействия, в котором поверхность дыхательных путей трахеи протирали в осевом направлении проволочной корзиной (N-Circle, нитиноловый экстрактор камней без наконечника NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, США) 30 стр. 28.Затем, примерно через 10 минут после возмущения в боксе биобезопасности, проводили трахеальное введение ЛВ-МП.
Магнитное поле, используемое в этом эксперименте, было настроено аналогично рентгеновскому исследованию in vivo, с теми же магнитами, которые удерживались над трахеей с помощью зажимов дистилляционного стента (рис. 4).Объем 50 мкл (2 аликвоты по 25 мкл) LV-MP доставляли в трахею (n = 3 животных) с помощью пипетки с гелевым наконечником, как описано ранее.Контрольная группа (n = 3 животных) получала тот же ЛЖ-МП без использования магнита.После завершения инфузии канюлю вынимают из эндотрахеальной трубки и животное экстубируют.Магнит остается на месте в течение 10 минут, прежде чем его удаляют.Крысам подкожно вводили мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австралия) с последующей отменой анестезии внутрибрюшинной инъекцией атипамазола гидрохлорида в дозе 1 мг/кг (Antisedan, Zoetis, Австралия).Крыс содержали в тепле и наблюдали до полного выхода из наркоза.
Устройство доставки ЛВ-МП в боксе биологической безопасности.Вы можете видеть, что светло-серая муфта Люэра ЭТ-трубки выступает изо рта, а кончик гелевой пипетки, показанный на рисунке, вставлен через ЭТ-трубку на нужную глубину в трахею.
Через неделю после процедуры введения LV-MP животных гуманно умерщвляли путем ингаляции 100% CO2 и оценивали экспрессию LacZ с использованием нашей стандартной обработки X-gal.Три самых каудальных хрящевых кольца были удалены, чтобы гарантировать, что любые механические повреждения или задержка жидкости из-за установки эндотрахеальной трубки не будут включены в анализ.Каждую трахею разрезали вдоль, чтобы получить две половинки для анализа, и помещали в чашку, содержащую силиконовый каучук (Sylgard, Dow Inc), с использованием иглы Minutien (Fine Science Tools) для визуализации поверхности просвета.Распределение и характер трансдуцированных клеток подтверждали фронтальной фотографией с использованием микроскопа Nikon (SMZ1500) с камерой DigiLite и программным обеспечением TCapture (Tucsen Photonics, Китай).Изображения были получены при 20-кратном увеличении (включая максимальную настройку для всей ширины трахеи), при этом вся длина трахеи отображалась шаг за шагом, обеспечивая достаточное перекрытие между каждым изображением, чтобы можно было «сшить» изображения.Изображения из каждой трахеи затем были объединены в одно составное изображение с помощью редактора композитных изображений версии 2.0.3 (Microsoft Research) с использованием алгоритма плоского движения. Область экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного определяли количественно с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с настройками 0,35 <Оттенок <0,58, Насыщенность> 0,15 и Значение <0,7. Область экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с настройками 0,35 <Оттенок <0,58, Насыщенность> 0,15 и Значение <0,7. Объем экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного был количественно определен с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как было установлено ранее28, использование с настройками 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Площадь экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного определяли количественно с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с настройками 0,35.0,15 и значение <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化, 使用0,35 < 色调< 0,58, 饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置.如 前所 述, 自动 自动 Matlab 脚本 （(r2020a ， Mathworks) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 .................... БЕДРО Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждое животное количественно производится с использованием использованного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как указано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного были количественно оценены с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <цветовой тон <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7.Путем отслеживания контуров ткани в GIMP v2.10.24 вручную создавалась маска для каждого составного изображения, чтобы идентифицировать область ткани и предотвратить любые ложные обнаружения за пределами ткани трахеи.Окрашенные площади всех составных изображений каждого животного суммировали, чтобы получить общую окрашенную площадь для этого животного.Затем окрашенную площадь разделили на общую площадь маски, чтобы получить нормализованную площадь.
Каждую трахею заливали в парафин и делали срезы толщиной 5 мкм.Срезы докрашивали нейтральным быстрым красным в течение 5 минут, а изображения получали с использованием микроскопа Nikon Eclipse E400, камеры DS-Fi3 и программного обеспечения для захвата элементов NIS (версия 5.20.00).
Все статистические анализы проводились в GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статистическая значимость была установлена ​​на уровне p ≤ 0,05.Нормальность проверяли с помощью теста Шапиро-Уилка, а различия в окрашивании LacZ оценивали с помощью непарного t-критерия.
Шесть МП, описанных в таблице 1, были исследованы с помощью PCXI, а видимость описана в таблице 2. Два полистирольных МП (MP1 и MP2; 18 мкм и 0,25 мкм соответственно) не были видны с помощью PCXI, но остальные образцы можно было идентифицировать. (примеры показаны на рисунке 5).МП3 и МП4 видны слабо (10-15% Fe3O4; 0,25 и 0,9 мкм соответственно).Хотя MP5 (98% Fe3O4; 0,25 мкм) содержал одни из самых мелких протестированных частиц, он был наиболее выраженным.Изделие CombiMag MP6 трудно отличить.Во всех случаях наша способность обнаруживать МП значительно улучшалась за счет перемещения магнита вперед и назад параллельно капилляру.Когда магниты удалялись от капилляра, частицы вытягивались длинными цепочками, но по мере приближения магнитов и увеличения напряженности магнитного поля цепочки частиц укорачивались, поскольку частицы мигрировали к верхней поверхности капилляра (см. дополнительное видео S1). : MP4), увеличивая плотность частиц на поверхности.И наоборот, когда магнит удаляется из капилляра, напряженность поля уменьшается, и МП перестраиваются в длинные цепочки, идущие от верхней поверхности капилляра (см. дополнительное видео S2: MP4).После того, как магнит перестает двигаться, частицы продолжают двигаться еще некоторое время после достижения положения равновесия.По мере того, как МП движется к верхней поверхности капилляра и от нее, магнитные частицы имеют тенденцию втягивать мусор через жидкость.
Видимость MP в PCXI значительно различается между образцами.(а) МП3, (б) МП4, (в) МП5 и (г) МП6.Все изображения, показанные здесь, были сделаны с помощью магнита, расположенного примерно в 10 мм непосредственно над капилляром.Видимые большие круги представляют собой пузырьки воздуха, захваченные в капиллярах, четко демонстрирующие черно-белые края фазово-контрастного изображения.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Обратите внимание, что диаметры магнитопроводов на всех рисунках указаны не в масштабе и примерно в 100 раз больше показанных.
Когда магнит движется влево и вправо вдоль верхней части капилляра, угол струны МП изменяется, выравниваясь с магнитом (см. Рисунок 6), таким образом очерчивая линии магнитного поля.Для МП3-5 после достижения хордой порогового угла частицы тянутся по верхней поверхности капилляра.Это часто приводит к тому, что MP группируются в более крупные группы вблизи мест, где магнитное поле наиболее сильное (см. дополнительное видео S3: MP5).Это также особенно очевидно при визуализации вблизи конца капилляра, что приводит к агрегации МП и концентрации на границе раздела жидкость-воздух.Частицы в MP6, которые было сложнее различить, чем в MP3-5, не тянулись при движении магнита вдоль капилляра, но струны MP диссоциировали, оставляя частицы в поле зрения (см. дополнительное видео S4: MP6).В некоторых случаях, когда приложенное магнитное поле уменьшалось путем перемещения магнита на большое расстояние от места визуализации, все оставшиеся МП медленно опускались на нижнюю поверхность трубки под действием силы тяжести, оставаясь в струне (см. Дополнительное видео S5: MP3). .
Угол струны МП меняется по мере движения магнита вправо над капилляром.(а) МП3, (б) МП4, (в) МП5 и (г) МП6.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Обратите внимание, что дополнительные видеоролики предназначены для информационных целей, поскольку они раскрывают важную структуру частиц и динамическую информацию, которую невозможно визуализировать на этих статических изображениях.
Наши испытания показали, что медленное перемещение магнита вперед и назад вдоль трахеи облегчает визуализацию МП в контексте сложного движения in vivo.Испытания in vivo не проводились, поскольку полистироловые шарики (MP1 и MP2) не были видны в капилляре.Каждое из оставшихся четырех МП испытывалось in vivo, располагая длинную ось магнита над трахеей под углом около 30° к вертикали (см. рисунки 2б и 3а), так как это приводило к более длинным цепочкам МП и было более эффективным. чем магнит..настройка прекращена.MP3, MP4 и MP6 не обнаружены в трахее ни одного живого животного.При визуализации дыхательных путей крыс после гуманного умерщвления животных частицы оставались невидимыми даже при добавлении дополнительного объема с помощью шприцевого насоса.MP5 имел самое высокое содержание оксида железа и был единственной видимой частицей, поэтому его использовали для оценки и характеристики поведения MP in vivo.
Размещение магнита над трахеей во время введения МП приводило к концентрации многих, но не всех МП в поле зрения.Поступление частиц в трахею лучше всего наблюдается у гуманно умерщвленных животных.Рисунок 7 и дополнительное видео S6: MP5 демонстрирует быстрый магнитный захват и выравнивание частиц на поверхности вентральной трахеи, что указывает на то, что MP можно направить в нужные области трахеи.При поиске более дистально по трахее после доставки МФ некоторые МФ были обнаружены ближе к килю, что указывает на недостаточную напряженность магнитного поля для сбора и удержания всех МФ, поскольку при введении жидкости они доставлялись через область максимальной напряженности магнитного поля.процесс.Однако послеродовые концентрации МП были выше вокруг области изображения, что позволяет предположить, что многие МП остались в областях дыхательных путей, где напряженность приложенного магнитного поля была самой высокой.
Изображения (а) до и (б) после доставки MP5 в трахею недавно усыпленной крысы с помощью магнита, помещенного чуть выше области визуализации.Изображенная область расположена между двумя хрящевыми кольцами.Перед введением МП в дыхательных путях имеется некоторое количество жидкости.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Эти изображения взяты из видео, представленного в S6: дополнительное видео MP5.
Перемещение магнита вдоль трахеи in vivo приводило к изменению угла цепи МП на поверхности дыхательных путей, аналогичному тому, что наблюдается в капиллярах (см. Рисунок 8 и дополнительное видео S7: MP5).Однако в нашем исследовании МП не удалось перетащить по поверхности живых дыхательных путей, как это могли бы сделать капилляры.В некоторых случаях цепочка МП удлиняется при движении магнита влево и вправо.Интересно, что мы также обнаружили, что цепочка частиц изменяет глубину поверхностного слоя жидкости, когда магнит перемещается в продольном направлении вдоль трахеи, и расширяется, когда магнит перемещается непосредственно над головой, а цепочка частиц поворачивается в вертикальное положение (см. Дополнительное видео S7).: MP5 на 0:09, внизу справа).Характерный характер движения менялся, когда магнит перемещали латерально по верхней части трахеи (т.е. влево или вправо от животного, а не по длине трахеи).Частицы все еще были четко видны во время их движения, но когда магнит был удален из трахеи, кончики цепочек частиц стали видны (см. Дополнительное видео S8: MP5, начиная с 0:08).Это согласуется с наблюдаемым поведением магнитного поля под действием приложенного магнитного поля в стеклянном капилляре.
Примеры изображений, показывающие MP5 в трахее живой наркотизированной крысы.(а) Магнит используется для получения изображений выше и слева от трахеи, затем (б) после перемещения магнита вправо.Красная рамка указывает увеличение, повышающее контраст.Эти изображения взяты из видео, представленного в дополнительном видео S7: MP5.
Когда два полюса были настроены в ориентации север-юг выше и ниже трахеи (т. е. притягивались; рис. 3б), хорды МП казались длиннее и располагались на латеральной стенке трахеи, а не на дорсальной поверхности трахеи. трахея (см. Приложение).Видео S9:MP5).Однако высокие концентрации частиц в одном месте (т.е. на дорсальной поверхности трахеи) не были обнаружены после введения жидкости с использованием устройства с двойным магнитом, что обычно происходит с устройством с одним магнитом.Затем, когда один магнит был настроен на отталкивание противоположных полюсов (рис. 3в), количество частиц, видимых в поле зрения, после доставки не увеличивалось.Установка обеих двух конфигураций магнитов является сложной задачей из-за высокой напряженности магнитного поля, которое притягивает или толкает магниты соответственно.Затем установку заменили на одиночный магнит, параллельный дыхательным путям, но проходящий через дыхательные пути под углом 90 градусов, так что силовые линии пересекали стенку трахеи ортогонально (рис. 3d), ориентация, предназначенная для определения возможности агрегации частиц на поверхности трахеи. боковая стенка.наблюдаться.Однако в этой конфигурации не было идентифицируемого движения накопления МП или движения магнита.На основании всех этих результатов для исследования носителей генов in vivo была выбрана конфигурация с одним магнитом и 30-градусной ориентацией (рис. 3а).
Когда животное визуализировали несколько раз сразу после гуманного умерщвления, отсутствие мешающего движению тканей означало, что в ясном межхрящевом поле можно было различить более тонкие и короткие линии частиц, «качающиеся» в соответствии с поступательным движением магнита.ясно видеть присутствие и движение частиц MP6.
Титр LV-LacZ составлял 1,8×108 МЕ/мл, и после смешивания 1:1 с CombiMag MP (MP6) животным вводили 50 мкл трахеальной дозы 9×107 МЕ/мл носителя LV (т.е. 4,5 х 106 ТЕ/крыса).)).В этих исследованиях вместо перемещения магнита во время родов мы фиксировали магнит в одном положении, чтобы определить, можно ли (а) улучшить трансдукцию ЛЖ по сравнению с векторной доставкой в ​​отсутствие магнитного поля и (б) можно ли улучшить проходимость дыхательных путей быть сосредоточены.Клетки трансдуцируются в магнитных целевых областях верхних дыхательных путей.
Наличие магнитов и использование CombiMag в сочетании с векторами LV, по-видимому, не оказали отрицательного воздействия на здоровье животных, в отличие от нашего стандартного протокола доставки векторов LV.Фронтальные изображения области трахеи, подвергнутой механическому возмущению (дополнительный рисунок 1), показали, что группа, получавшая LV-MP, имела значительно более высокие уровни трансдукции в присутствии магнита (рис. 9a).В контрольной группе присутствовало лишь небольшое количество синего окрашивания LacZ (рис. 9b).Количественная оценка нормализованных областей, окрашенных X-Gal, показала, что введение LV-MP в присутствии магнитного поля приводило примерно к 6-кратному улучшению (рис. 9c).
Пример составных изображений, демонстрирующих трахеальную трансдукцию с помощью LV-MP (а) в присутствии магнитного поля и (б) в отсутствие магнита.(в) Статистически значимое улучшение нормализованной площади трансдукции LacZ в трахее при использовании магнита (*p = 0,029, t-критерий, n = 3 на группу, среднее значение ± стандартная ошибка среднего).
Срезы, окрашенные в нейтральный быстрый красный цвет (пример показан на дополнительном рисунке 2), показали, что окрашенные LacZ клетки присутствовали в том же образце и в том же месте, что и сообщалось ранее.
Ключевой задачей генной терапии дыхательных путей остается точная локализация частиц-носителей в интересующих областях и достижение высокого уровня эффективности трансдукции в мобильном легком при наличии воздушного потока и активного клиренса слизи.Для носителей ЛВ, предназначенных для лечения респираторных заболеваний при муковисцидозе, увеличение времени пребывания частиц носителя в проводящих дыхательных путях до сих пор было недостижимой целью.Как отметили Кастеллани и др., использование магнитных полей для усиления трансдукции имеет преимущества перед другими методами доставки генов, такими как электропорация, поскольку оно может сочетать в себе простоту, экономичность, локализованную доставку, повышенную эффективность и более короткое время инкубации.и, возможно, более низкая доза носителя10.Однако осаждение и поведение магнитных частиц в дыхательных путях in vivo под воздействием внешних магнитных сил никогда не было описано, и фактически способность этого метода повышать уровни экспрессии генов в неповрежденных живых дыхательных путях не была продемонстрирована in vivo.
Наши эксперименты in vitro на синхротроне PCXI показали, что все протестированные нами частицы, за исключением полистирола MP, были видимы на используемой нами установке визуализации.При наличии магнитного поля магнитные поля образуют струны, длина которых связана с типом частиц и силой магнитного поля (т. е. близостью и движением магнита).Как показано на рисунке 10, наблюдаемые нами струны формируются, когда каждая отдельная частица намагничивается и индуцирует собственное локальное магнитное поле.Эти отдельные поля заставляют другие подобные частицы собираться и соединяться с движениями групповых струн за счет местных сил, возникающих из-за локальных сил притяжения и отталкивания других частиц.
На диаграмме показаны (а, б) цепочки частиц, образующиеся внутри капилляров, заполненных жидкостью, и (в, г) заполненная воздухом трахея.Обратите внимание, что капилляры и трахея нарисованы не в масштабе.На панели (а) также приведено описание МЖ, содержащих частицы Fe3O4, расположенные в цепочки.
При движении магнита над капилляром угол струны частиц достигал критического порога для МП3-5, содержащего Fe3O4, после чего струна частиц уже не оставалась в исходном положении, а перемещалась вдоль поверхности в новое положение.магнит.Этот эффект, вероятно, возникает потому, что поверхность стеклянного капилляра достаточно гладкая, чтобы позволить произойти этому движению.Интересно, что MP6 (CombiMag) вёл себя иначе, возможно, потому, что частицы были меньше, имели другое покрытие или поверхностный заряд, или запатентованная жидкость-носитель влияла на их способность двигаться.Контраст на изображении частиц CombiMag также слабее, что позволяет предположить, что жидкость и частицы могут иметь одинаковую плотность и, следовательно, не могут легко двигаться навстречу друг другу.Частицы также могут застрять, если магнит движется слишком быстро, что указывает на то, что сила магнитного поля не всегда может преодолеть трение между частицами в жидкости, что позволяет предположить, что напряженность магнитного поля и расстояние между магнитом и целевой областью не должны учитываться. сюрприз.важный.Эти результаты также показывают, что, хотя магниты могут захватывать множество микрочастиц, проходящих через целевую область, маловероятно, что магниты могут перемещать частицы CombiMag вдоль поверхности трахеи.Таким образом, мы пришли к выводу, что исследования MF LV in vivo должны использовать статические магнитные поля для физического воздействия на определенные области дерева дыхательных путей.
После того, как частицы доставлены в организм, их трудно идентифицировать в контексте сложной движущейся ткани тела, но их способность обнаружения была улучшена за счет перемещения магнита горизонтально над трахеей, чтобы «покачивать» струны МП.Хотя визуализация в режиме реального времени возможна, легче различить движение частиц после того, как животное было гуманно убито.Концентрации MP обычно были самыми высокими в этом месте, когда магнит располагался над областью визуализации, хотя некоторые частицы обычно обнаруживались дальше по трахее.В отличие от исследований in vitro, частицы не могут быть перенесены в трахею движением магнита.Это открытие согласуется с тем, как слизь, покрывающая поверхность трахеи, обычно обрабатывает вдыхаемые частицы, улавливая их в слизи и впоследствии выводя их через механизм мукоцилиарного клиренса.
Мы предположили, что использование магнитов выше и ниже трахеи для притяжения (рис. 3б) может привести к созданию более однородного магнитного поля, а не магнитного поля, которое сильно сконцентрировано в одной точке, что потенциально может привести к более равномерному распределению частиц..Однако наше предварительное исследование не обнаружило четких доказательств в поддержку этой гипотезы.Аналогично, настройка пары магнитов на отталкивание (рис. 3в) не привела к большему осаждению частиц в области изображения.Эти два вывода показывают, что установка с двумя магнитами существенно не улучшает локальный контроль наведения MP и что возникающие в результате сильные магнитные силы трудно настроить, что делает этот подход менее практичным.Аналогичным образом, ориентация магнита над трахеей и поперек нее (рис. 3d) также не увеличивала количество частиц, остающихся в области изображения.Некоторые из этих альтернативных конфигураций могут оказаться неэффективными, поскольку они приводят к снижению напряженности магнитного поля в зоне осаждения.Таким образом, конфигурация с одним магнитом под углом 30 градусов (рис. 3а) считается самым простым и эффективным методом тестирования in vivo.
Исследование LV-MP показало, что когда векторы LV комбинировались с CombiMag и доставлялись после физического нарушения в присутствии магнитного поля, уровни трансдукции в трахее значительно увеличивались по сравнению с контролем.Основываясь на исследованиях синхротронной визуализации и результатах LacZ, магнитное поле, по-видимому, способно удерживать ЛЖ в трахее и уменьшать количество векторных частиц, которые сразу же проникают глубоко в легкие.Такие улучшения направленности могут привести к повышению эффективности при одновременном снижении доставляемых титров, ненаправленной трансдукции, воспалительных и иммунных побочных эффектов, а также затрат на перенос генов.Важно отметить, что, по словам производителя, CombiMag можно использовать в сочетании с другими методами переноса генов, включая другие вирусные векторы (например, AAV) и нуклеиновые кислоты.