Благодарим вас за посещение Nature.com.Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Toxoplasma gondii — внутриклеточный простейший паразит, который модулирует микроокружение инфицированного хозяина и, как известно, связан с частотой роста опухоли головного мозга.В этом исследовании мы предполагаем, что экзосомальная микроРНК-21, вызванная токсоплазменной инфекцией, способствует росту опухоли головного мозга.Были охарактеризованы экзосомы микроглии BV2, инфицированной токсоплазмой, и подтверждена интернализация клеток глиомы U87.Профили экспрессии экзосомальных микроРНК анализировали с использованием массивов микроРНК и микроРНК-21A-5p, связанных с Toxoplasma gondii и сортировкой опухолей.Мы также исследовали уровни мРНК опухолеассоциированных генов в клетках глиомы U87 путем изменения уровней миР-21 в экзосомах и влияния экзосом на пролиферацию клеток глиомы человека U87.В экзосомах клеток глиомы U87, инфицированных Toxoplasma gondii, повышается экспрессия микроРНК-21 и снижается активность противоопухолевых генов (FoxO1, PTEN и PDCD4).Экзосомы, происходящие из BV2, инфицированные токсоплазмой, индуцируют пролиферацию клеток глиомы U87.Экзосомы индуцируют рост клеток U87 на модели опухоли мыши.Мы предполагаем, что увеличение экзосомальной миР-21 в микроглии BV2, инфицированной токсоплазмой, может играть важную роль в качестве промотора клеточного роста в клетках глиомы U87 путем подавления противоопухолевых генов.
По оценкам, в 2018 году во всем мире было диагностировано более 18,1 миллиона случаев запущенного рака, при этом ежегодно диагностируется около 297 000 опухолей центральной нервной системы (1,6% всех опухолей)1.Предыдущие исследования показали, что факторы риска развития опухолей головного мозга у человека включают различные химические продукты, семейный анамнез и ионизирующее излучение от терапевтического и диагностического оборудования для головы.Однако точная причина этих злокачественных новообразований неизвестна.Примерно 20% всех случаев рака во всем мире вызваны инфекционными агентами, включая вирусы, бактерии и паразиты3,4.Инфекционные патогены нарушают генетические механизмы клетки-хозяина, такие как восстановление ДНК и клеточный цикл, и могут привести к хроническому воспалению и повреждению иммунной системы5.
Инфекционные агенты, ассоциированные с раком человека, являются наиболее распространенными вирусными патогенами, включая вирусы папилломы человека и вирусы гепатитов В и С.Паразиты также могут играть потенциальную роль в развитии рака у человека.Несколько видов паразитов, а именно Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis и Hymenolepis nana, вовлечены в различные виды рака человека 6,7,8.
Toxoplasma gondii — внутриклеточное простейшее, регулирующее микроокружение инфицированных клеток-хозяев.По оценкам, этим паразитом заражено около 30% населения мира, подвергая риску все население9,10.Toxoplasma gondii может инфицировать жизненно важные органы, включая центральную нервную систему (ЦНС), и вызывать серьезные заболевания, такие как смертельный менингит и энцефалит, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом9.Однако Toxoplasma gondii может также изменять среду инфицированного хозяина, модулируя рост клеток и иммунные реакции у иммунокомпетентных людей, что приводит к поддержанию бессимптомной хронической инфекции9,11.Интересно, что, учитывая корреляцию между распространенностью T. gondii и частотой возникновения опухолей головного мозга, некоторые сообщения предполагают, что изменения окружающей среды хозяина in vivo из-за хронической инфекции T. gondii напоминают микроокружение опухоли.
Экзосомы известны как межклеточные коммуникаторы, которые доставляют биологическое содержимое, включая белки и нуклеиновые кислоты, из соседних клеток16,17.Экзосомы могут влиять на связанные с опухолью биологические процессы, такие как антиапоптоз, ангиогенез и метастазирование в микроокружении опухоли.В частности, микроРНК (миРНК), небольшие некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, являются важными посттранскрипционными регуляторами генов, которые контролируют более 30% мРНК человека посредством комплекса молчания, индуцированного микроРНК (миРИСК).Toxoplasma gondii может нарушать биологические процессы, контролируя экспрессию микроРНК у инфицированных хозяев.МикроРНК хозяина содержат важные сигналы для регуляции биологических процессов хозяина для достижения стратегии выживания паразита.Таким образом, изучение изменений в профиле микроРНК хозяина при заражении T. gondii может помочь нам более четко понять взаимодействие между хозяином и T. gondii.Действительно, Тируньянам и др.15 предположили, что T. gondii способствует канцерогенезу головного мозга, изменяя его экспрессию на специфических микроРНК хозяина, связанных с ростом опухоли, и обнаружили, что T. gondii может вызывать глиомы у экспериментальных животных.
Это исследование сосредоточено на изменении экзосомальной миР-21 в микроглии хозяина, инфицированной токсоплазмой BV2.Мы наблюдали возможную роль измененной экзосомальной миР-21 в росте клеток глиомы U87 вследствие сохранения в ядре FoxO1/p27, который является мишенью сверхэкспрессируемой миР-21.
Экзосомы, полученные из BV2, были получены с помощью дифференциального центрифугирования и проверены различными методами на предмет предотвращения загрязнения клеточными компонентами или другими везикулами.Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) показал четкие закономерности между белками, экстрагированными из клеток BV2 и экзосом (рис. 1А), а образцы оценивали на наличие Аликса, который анализировали с помощью вестерн-блоттинга маркеров экзосомальных белков.Мечение Alix было обнаружено в белках экзосом, но не в белках лизата клеток BV2 (рис. 1B).Кроме того, очищенную РНК из экзосом, полученных из BV2, анализировали с помощью биоанализатора.Субъединицы рибосом 18S и 28S редко наблюдались в структуре миграции экзосомальной РНК, что указывает на надежную чистоту (рис. 1C).Наконец, трансмиссионная электронная микроскопия показала, что наблюдаемые экзосомы имели размер около 60–150 нм и имели чашеобразную структуру, типичную для морфологии экзосом (рис. 1D).
Характеристика экзосом, полученных из клеток BV2.(A) Страница паспорта безопасности.Белки выделяли из клеток BV2 или экзосом, полученных из BV2.Структура белков различается в клетках и экзосомах.(B) Вестерн-блот-анализ экзосомального маркера (Alix).(C) Оценка очищенной РНК из клеток BV2 и экзосом, полученных из BV2, с использованием биоанализатора.Таким образом, 18S и 28S рибосомальные субъединицы в клетках BV2 редко обнаруживаются в экзосомальной РНК.(D) Просвечивающая электронная микроскопия показала, что экзосомы, выделенные из клеток BV2, были отрицательно окрашены 2% уранилацетатом.Экзосомы имеют размер примерно 60-150 нм и чашеобразную форму (Сонг и Юнг, неопубликованные данные).
Клеточная интернализация экзосом, происходящих из BV2, в клетки глиомы человека U87 наблюдалась с помощью конфокальной микроскопии.Экзосомы, меченные PKH26, локализованы в цитоплазме клеток U87.Ядра были окрашены DAPI (рис. 2А), что указывает на то, что экзосомы, происходящие из BV2, могут интернализоваться клетками-хозяевами и влиять на среду клеток-реципиентов.
Интернализация экзосом, происходящих из BV2, в клетки глиомы U87 и экзосом, происходящих из BV2, инфицированных Toxoplasma RH, индуцировала пролиферацию клеток глиомы U87.(A) Экзосомы, поглощенные клетками U87, измеренные с помощью конфокальной микроскопии.Клетки глиомы U87 инкубировали с экзосомами, меченными PKH26 (красный) или без контроля, в течение 24 часов.Ядра окрашивали DAPI (синий), а затем наблюдали под конфокальным микроскопом (шкала: 10 мкм, x 3000).(B) Пролиферацию клеток глиомы U87 определяли с помощью анализа клеточной пролиферации.Клетки глиомы U87 обрабатывали экзосомами в течение указанного времени. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 по критерию Стьюдента. *P < 0,05. *Р < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
После подтверждения интернализации экзосом, происходящих из BV2, в клетки глиомы U87, мы провели анализы клеточной пролиферации, чтобы изучить роль экзосом, происходящих из токсоплазмы, происходящих из BV2, в развитии клеток глиомы человека.Обработка клеток U87 экзосомами из клеток BV2, инфицированных T. gondii, показала, что экзосомы, полученные из BV2, инфицированные T. gondii, вызывали значительно более высокую пролиферацию клеток U87 по сравнению с контролем (рис. 2B).
Кроме того, рост клеток U118 имел те же результаты, что и U87, поскольку экзосомы, стимулированные токсоплазмой, вызывали самые высокие уровни пролиферации (данные не показаны).На основании этих данных мы можем указать, что экзосомы, инфицированные токсоплазмой BV2, играют важную роль в пролиферации клеток глиомы.
Чтобы исследовать влияние экзосом, полученных из BV2, инфицированных токсоплазмой, на развитие опухоли, мы инъецировали клетки глиомы U87 голым мышам для модели ксенотрансплантата и инъецировали экзосомы, полученные из BV2, или экзосомы, полученные из BV2, инфицированные RH.После того, как опухоли стали заметными через 1 неделю, каждую экспериментальную группу из 5 мышей разделили в соответствии с размером опухоли, чтобы определить одну и ту же отправную точку, и размер опухоли измеряли в течение 22 дней.
У мышей с моделью ксенотрансплантата U87 значительно больший размер и вес опухоли наблюдались в группе экзосом, инфицированных RH, происходящих из BV2, на 22-й день (рис. 3A, B).С другой стороны, после лечения экзосомами не было значительной разницы в размере опухоли между группой экзосом, полученных из BV2, и контрольной группой.Кроме того, мыши, которым инъецировали клетки глиомы и экзосомы, визуально демонстрировали самый большой объем опухоли в группе экзосом, полученных из BV2, инфицированных RH (рис. 3C).Эти результаты демонстрируют, что экзосомы, полученные из BV2, инфицированные токсоплазмой, индуцируют рост глиомы на модели опухоли мыши.
Онкогенез (AC) экзосом, происходящих из BV2, на мышиной модели ксенотрансплантата U87.Размер опухоли (A) и вес (B) были значительно увеличены у голых мышей BALB/c, обработанных RH-инфицированными экзосомами, полученными из BV2.Голым мышам BALB/c (C) подкожно инъецировали 1×107 клеток U87, суспендированных в смеси Matrigel.Через шесть дней после инъекции мышам вводили 100 мкг экзосом, полученных из BV2.Размер и массу опухоли измеряли в указанные дни и после умерщвления соответственно. *Р <0,05. *Р <0,05. *Р < 0,05. *Р <0,05. *P <0,05。 *P <0,05。 *Р < 0,05. *Р <0,05.
Данные показали, что 37 микроРНК (16 сверхэкспрессированных и 21 пониженная экспрессия), связанных с иммунитетом или развитием опухоли, были значительно изменены в микроглии после заражения штаммом Toxoplasma RH (рис. 4А).Относительные уровни экспрессии миР-21 среди измененных миРНК были подтверждены с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени в экзосомах, полученных из BV2, экзосомах, обработанных клетками BV2 и U87.Экспрессия миР-21 показала значительное увеличение экзосом из клеток BV2, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм RH) (рис. 4Б).Относительные уровни экспрессии миР-21 в клетках BV2 и U87 увеличивались после поглощения измененных экзосом (рис. 4Б).Относительные уровни экспрессии миР-21 в тканях головного мозга онкологических больных и мышей, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм МЕ49), были выше, чем в контроле соответственно (рис. 4В).Эти результаты коррелируют с различиями между уровнями экспрессии предсказанных и подтвержденных микроРНК in vitro и in vivo.
Изменения экспрессии экзосомальной miP-21a-5p в микроглии, инфицированной Toxoplasma gondii (RH).(A) Демонстрирует значительные изменения в siRNA, связанные с иммунитетом или развитием опухоли после инфекции T. gondii RH.(B) Относительные уровни экспрессии миР-21 были обнаружены с помощью RT-PCR в реальном времени в экзосомах, полученных из BV2, экзосомах, обработанных BV2, и клетках U87.(C) Относительные уровни экспрессии миР-21 были обнаружены в тканях головного мозга больных раком (N=3) и мышей, инфицированных Toxoplasma gondii (штамм ME49) (N=3). *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 было получено с использованием t-критерия Стьюдента. *P < 0,05. *Р < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
Экзосомы из RH-инфицированных клеток BV2 приводили к росту глиом in vivo и in vitro (рис. 2, 3).Чтобы обнаружить соответствующие мРНК, мы исследовали уровни мРНК противоопухолевых целевых генов, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN и запрограммированной гибели клеток 4 (PDCD4) в клетках U87, инфицированных экзосомами, полученными из BV2 или RH BV2.Биоинформатический анализ показал, что несколько генов, ассоциированных с опухолью, включая гены FoxO1, PTEN и PDCD4, имеют сайты связывания miR-2121,22.Уровни мРНК противоопухолевых генов-мишеней были снижены в экзосомах, происходящих из BV2, инфицированных RH, по сравнению с экзосомами, происходящими из BV2 (рис. 5А).FoxO1 показал пониженные уровни белка в экзосомах, происходящих из BV2, инфицированных RH, по сравнению с экзосомами, происходящими из BV2 (рис. 5B).Основываясь на этих результатах, мы могли подтвердить, что экзосомы, полученные из RH-инфицированного BV2, подавляют антионкогенные гены, сохраняя их роль в росте опухоли.
Экзосомы, происходящие из BV2, инфицированные токсоплазмой RH, индуцируют подавление противоопухолевых генов в клетках глиомы U87 экзосомами, инфицированными токсоплазмой RH, происходящими из BV2.(A) ПЦР в реальном времени экспрессии FoxO1, PTEN и PDCD4 в экзосомах, полученных из BV2, инфицированного T. gondii RH, по сравнению с экзосомами PBS.В качестве контроля использовали мРНК β-актина.(B) Экспрессию FoxO1 определяли с помощью вестерн-блоттинга, а данные денситометрии статистически оценивали с использованием программы ImageJ. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 было получено с использованием t-критерия Стьюдента. *P < 0,05. *Р < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 получено с использованием t-критерия Стьюдента.
Чтобы понять влияние miP-21 в экзосомах на регуляцию опухолеассоциированных генов, клетки U87 трансфицировали ингибитором miP-21 с использованием липофектамина 2000, и клетки собирали через 24 часа после трансфекции.Уровни экспрессии FoxO1 и p27 в клетках, трансфицированных ингибиторами miR-21, сравнивали с клетками, обработанными экзосомами, полученными из BV2, с помощью qRT-PCR (рис. 6A,B).Трансфекция ингибитора миР-21 в клетки U87 значительно снижала экспрессию FoxO1 и p27 (фиг. 6).
RH-инфицированная экзосомальная миР-21, происходящая из BV2, изменяла экспрессию FoxO1/p27 в клетках глиомы U87.Клетки U87 трансфицировали ингибитором miP-21 с использованием липофектамина 2000 и клетки собирали через 24 часа после трансфекции.Уровни экспрессии FoxO1 и p27 в клетках, трансфицированных ингибиторами miR-21, сравнивали с уровнями в клетках, обработанных экзосомами, полученными из BV2, с помощью qRT-PCR (A, B).
Чтобы избежать иммунного ответа хозяина, паразит токсоплазма трансформируется в тканевую кисту.Они паразитируют в различных тканях, включая мозг, сердце и скелетные мышцы, на протяжении всей жизни хозяина и модулируют иммунный ответ хозяина.Кроме того, они могут регулировать клеточный цикл и апоптоз клеток-хозяев, способствуя их пролиферации14,24.Toxoplasma gondii преимущественно инфицирует дендритные клетки хозяина, нейтрофилы и моноциты/макрофаги, включая микроглию головного мозга.Toxoplasma gondii индуцирует дифференцировку макрофагов фенотипа М2, влияет на заживление ран после заражения возбудителем, а также связана с гиперваскуляризацией и гранулематозным фиброзом.Такой поведенческий патогенез токсоплазменной инфекции может быть связан с маркерами, связанными с развитием опухоли.Враждебная среда, регулируемая токсоплазмой, может напоминать соответствующий предрак.Следовательно, можно предположить, что токсоплазменная инфекция должна способствовать развитию опухолей головного мозга.Фактически, высокие показатели заражения токсоплазмой были зарегистрированы в сыворотке пациентов с различными опухолями головного мозга.Кроме того, Toxoplasma gondii может быть еще одним канцерогенным эффектором и действовать синергически, помогая другим инфекционным канцерогенам развивать опухоли головного мозга.В связи с этим стоит отметить, что P. falciparum и вирус Эпштейна-Барра синергически способствуют формированию лимфомы Беркитта.
Роль экзосом как регуляторов в области исследований рака тщательно изучалась.Однако роль экзосом между паразитами и инфицированными хозяевами остается плохо изученной.На данный момент различные регуляторы, в том числе секретируемые белки, объяснили биологические процессы, с помощью которых простейшие паразиты сопротивляются атаке хозяина и поддерживают инфекцию.В последнее время растет представление о том, что микровезикулы, ассоциированные с простейшими, и их микроРНК взаимодействуют с клетками-хозяевами, создавая благоприятную среду для их выживания.Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы обнаружить связь между измененными экзосомальными микроРНК и пролиферацией клеток глиомы.Изменение микроРНК (кластерные гены miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 и miR-17-92) связывается с промотором STAT3 в макрофагах человека, инфицированных токсоплазмой, регулируется и индуцирует антигенную реакцию. -апоптоз в ответ на инфекцию Toxoplasma gondii 29 .Токсоплазменная инфекция увеличивает экспрессию miR-17-5p и miR-106b-5p, которые связаны с несколькими гиперпролиферативными заболеваниями 30 .Эти данные позволяют предположить, что микроРНК хозяина, регулируемые токсоплазменной инфекцией, являются важными молекулами для выживания паразитов и патогенеза биологического поведения хозяина.
Измененные микроРНК могут влиять на различные типы поведения во время инициации и прогрессирования злокачественных клеток, включая глиомы: самодостаточность сигналов роста, нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост, уклонение от апоптоза, неограниченный репликационный потенциал, ангиогенез, инвазия и метастазирование, воспаление.При глиоме измененные микроРНК были идентифицированы в нескольких исследованиях по профилированию экспрессии.
В настоящем исследовании мы подтвердили высокие уровни экспрессии микроРНК-21 в клетках-хозяевах, инфицированных токсоплазмой.миР-21 была идентифицирована как одна из наиболее часто сверхэкспрессируемых микроРНК в солидных опухолях, включая глиомы, 33, и ее экспрессия коррелирует со степенью глиомы.Накопленные данные свидетельствуют о том, что миР-21 представляет собой новый онкоген, который действует как антиапоптотический фактор при росте глиомы и сильно сверхэкспрессируется в тканях и плазме злокачественных новообразований головного мозга человека.Интересно, что инактивация миР-21 в клетках и тканях глиомы запускает ингибирование пролиферации клеток за счет каспазозависимого апоптоза.Биоинформатический анализ предсказанных мишеней miR-21 выявил множественные гены-супрессоры опухолей, связанные с путями апоптоза, включая запрограммированную клеточную смерть 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN и forkhead box O1 (FoxO1), с сайтом связывания miR-2121..22.38.
FoxO1, как один из факторов транскрипции (FoxO), участвует в развитии различных типов рака человека и может регулировать экспрессию генов-супрессоров опухолей, таких как p21, p27, Bim и FasL40.FoxO1 может связывать и активировать ингибиторы клеточного цикла, такие как p27, для подавления роста клеток.Более того, FoxO1 является ключевым эффектором передачи сигналов PI3K/Akt и регулирует многие биологические процессы, такие как развитие клеточного цикла и дифференцировка клеток посредством активации транскрипции p2742.
В заключение мы полагаем, что экзосомальная миР-21, полученная из инфицированной токсоплазмой микроглии, может играть важную роль в качестве регулятора роста клеток глиомы (рис. 7).Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти прямую связь между экзосомальной миР-21, измененной токсоплазменной инфекцией и ростом глиомы.Ожидается, что эти результаты станут отправной точкой для изучения связи между токсоплазменной инфекцией и заболеваемостью глиомой.
В работе предложена принципиальная схема механизма канцерогенеза глиомы (мозга).Автор рисует в PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Все экспериментальные протоколы в этом исследовании, включая использование животных, соответствовали Стандартным этическим принципам Комитета по уходу за животными и пользователям Сеульского национального университета и были одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинского факультета Сеульского национального университета (номер IRB SNU- 150715).-2).Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE.
Микроглию мыши BV2 и клетки глиомы человека U87 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Welgene, Сеул, Корея) и среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), соответственно, каждая из которых содержала 10% фетальной бычьей сыворотки, 4 мМ l- глутамин, 0,2 мМ пенициллин и 0,05 мМ стрептомицин.Клетки культивировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C.Другая линия клеток глиомы, U118, использовалась для сравнения с клетками U87.
Для выделения экзосом из штаммов RH и ME49, инфицированных T. gondii, тахизоиты T. gondii (штамм RH) собирали из брюшной полости 6-недельных мышей BALB/c, которым инъецировали за 3-4 дня до этого.Тахизоиты трижды промывали PBS и очищали центрифугированием в 40% Percoll (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США)43.Для получения тахизоитов штамма МЕ49 мышам BALB/c внутрибрюшинно вводили 20 тканевых кист и трансформацию тахизоитов в кистах собирали путем промывания брюшной полости на 6-8-й день после заражения (ПИ).Мыши, инфицированные PBS.Тахизоиты ME49 выращивали в клетках, дополненных 100 мкг/мл пенициллина (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco/BRL) и 5% фетальной бычьей сыворотки (Lonza, Walkersville, MD). .., США) при 37°С и 5% углекислого газа.После культивирования в клетках Vero тахизоиты ME49 дважды пропускали через иглу калибра 25, а затем через фильтр 5 мкм для удаления дебриса и клеток.После промывки тахизоиты ресуспендировали в PBS44.Тканевые кисты штамма ME49 Toxoplasma gondii поддерживались путем внутрибрюшинной инъекции кист, выделенных из мозга инфицированных мышей C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Соннам, Корея).Мозг мышей, инфицированных ME49, собирали через 3 месяца после ИП и измельчали ​​под микроскопом для выделения кист.Инфицированные мыши содержались в специальных беспатогенных условиях (SPF) на медицинском факультете Сеульского национального университета.
Тотальную РНК экстрагировали из экзосом, происходящих из BV2, клеток и тканей BV2 с использованием мини-набора miRNeasy (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя, включая время инкубации для этапа элюирования.Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000.Качество микрочипов РНК оценивали с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Амстелвен, Нидерланды).
DMEM с 10% FBS с низким содержанием экзосом готовили ультрацентрифугированием при 100 000 g в течение 16 часов при 4 ° C и фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Nalgene, Рочестер, Нью-Йорк, США).Клетки BV2, 5 × 105, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% обедненной экзосомами FBS и 1% антибиотиков, при 37°C и 5% CO2.После 24 часов инкубации к клеткам добавляли тахизоиты штамма RH или ME49 (MOI = 10), а неинвазивные паразиты удаляли в течение часа и повторно заполняли DMEM.Экзосомы из клеток BV2 были выделены модифицированным дифференциальным центрифугированием, наиболее широко используемым методом.Ресуспендируйте осадок экзосом в 300 мкл PBS для анализа РНК или белка.Концентрацию изолированных экзосом определяли с использованием набора для анализа белка BCA (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США) и спектрофотометра NanoDrop 2000.
Осадки клеток BV2 или экзосом, полученных из BV2, лизировали в растворе для экстракции белка PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Соннам, Корея) и белки наносили на окрашенные кумасси бриллиантовым синим 10% полиакриламидные гели с ДСН.Кроме того, белки переносили на мембраны из ПВДФ в течение 2 часов.Вестерн-блоттинг был подтвержден с использованием антитела Alix (Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс, США) в качестве экзосомального маркера.В качестве вторичного антитела использовали HRP-конъюгированный козий антимышиный IgG (H + L) (Bmethyl Laboratories, Монтгомери, Техас, США) и люминесцентный анализатор изображений LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Токио, Япония)..Просвечивающую электронную микроскопию проводили для изучения размера и морфологии экзосом.Экзосомы, выделенные из клеток BV2 (6,40 мкг/мкл), готовили на сетках, покрытых углеродом, и отрицательно окрашивали 2% уранилацетатом в течение 1 минуты.Подготовленные образцы наблюдали при ускоряющем напряжении 80 кВ с помощью прибора JEOL 1200-EX II (Токио, Япония), оснащенного ПЗС-камерой ES1000W Erlangshen (Гатан, Плезантон, Калифорния, США).
Экзосомы, полученные из BV2, окрашивали с использованием набора красных флуоресцентных линкеров PKH26 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 15 минут при комнатной температуре.Клетки U87, 2×105, с экзосомами, меченными PKH26 (красный) или без экзосом в качестве отрицательного контроля, инкубировали при 37°C в течение 24 часов в инкубаторе с 5% CO2.Ядра клеток U87 окрашивали DAPI (синий), клетки U87 фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при 4°C, а затем анализировали в системе конфокального микроскопа Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Мангейм, Германия).наблюдаемый.
кДНК синтезировали из миРНК с использованием синтеза первой цепи миРНК Mir-X и набора SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Шига, Япония).Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) с использованием праймеров и матриц, смешанных с SYBR Premix.ДНК амплифицировали в течение 40 циклов денатурации при 95°С в течение 15 с и отжига при 60°С в течение 60 с.Данные каждой реакции ПЦР анализировали с использованием модуля анализа данных программного обеспечения оптической системы iQ™5 (Bio-Rad).Относительные изменения в экспрессии генов между выбранными генами-мишенями и β-актином/миРНК (и U6) рассчитывали с использованием метода стандартной кривой.Используемые последовательности праймеров показаны в таблице 1.
3×104 клеток глиомы U87 высевали в 96-луночные планшеты и смешивали с инфицированными токсоплазмой экзосомами, полученными из BV2 (50 мкг/мл), или неимпульсными экзосомами, полученными из BV2 (50 мкг/мл), в качестве контроля через 12, 18 и 36 часов. .Скорость пролиферации клеток определяли с использованием набора для подсчета клеток-8 (Dojindo, Кумамото, Япония) (дополнительные рисунки S1-S3) 46 .
Самки голых мышей BALB/c в возрасте 5 недель были приобретены у Orient Bio (Соннамси, Южная Корея) и содержались индивидуально в стерильных клетках при комнатной температуре (22±2°C) и влажности (45±15°C).%) при комнатной температуре (22±2°С) и влажности (45±15%).12-часовой световой цикл и 12-часовой темновой цикл проводились под SPF (Центр животных Медицинской школы Сеульского национального университета).Мышей случайным образом разделили на три группы по 5 мышей в каждой, и всем группам подкожно инъецировали 400 мл PBS, содержащего 1×107 клеток глиомы U87 и BD Matrigel™ со сниженным фактором роста (BD Science, Майами, Флорида, США).Через шесть дней после инъекции опухоли в участок опухоли вводили 200 мг экзосом, полученных из клеток BV2 (с токсоплазменной инфекцией или без нее).Через двадцать два дня после инфицирования опухолью размер опухоли мышей в каждой группе измеряли штангенциркулем три раза в неделю, а объем опухоли рассчитывали по формуле: 0,5×(ширина)×2×длина.
Анализ экспрессии микроРНК с использованием массива микроРНК miRCURYTM LNA, массивов has, mmu и rno 7-го поколения (EXIQON, Ведбек, Дания), охватывающий 1119 хорошо охарактеризованных мышей среди 3100 зондов захвата микроРНК человека, мыши и крысы.Во время этой процедуры от 250 до 1000 нг тотальной РНК было удалено из 5'-фосфата путем обработки щелочной фосфатазой кишечника теленка с последующим мечением зеленым флуоресцентным красителем Hy3.Меченые образцы затем гибридизовали путем загрузки предметных стекол микроматрицы с использованием набора камер для гибридизации (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) и набора слайдов для гибридизации (Agilent Technologies).Гибридизацию проводили в течение 16 часов при температуре 56°С, затем микрочипы промывали в соответствии с рекомендациями производителя.Обработанные предметные стекла микрочипов затем сканировали с помощью системы сканирования микрочипов Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Отсканированные изображения были импортированы с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction версии 10.7.3.1 (Agilent Technologies), а интенсивность флуоресценции каждого изображения определялась количественно с использованием соответствующего файла GAL модифицированного протокола Exiqon.Данные микрочипов для текущего исследования хранятся в базе данных GEO под номером GPL32397.
Профили экспрессии зрелых экзосомальных микроРНК в микроглии штаммов RH или ME49, инфицированных токсоплазмой, анализировали с использованием различных сетевых инструментов.микроРНК, связанные с развитием опухоли, были идентифицированы с использованием miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) и отфильтрованы с нормализованной интенсивностью сигнала (log2), превышающей 8,0.Среди микроРНК было обнаружено, что дифференциально экспрессируемые микроРНК изменяются более чем в 1,5 раза с помощью фильтрационного анализа микроРНК, измененных штаммами RH или ME49, инфицированными T. gondii.
Клетки высевали в шестилуночные планшеты (3×105 клеток/лунку) в opti-MEM (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).Трансфицированные клетки культивировали в течение 6 часов, а затем среду заменяли на свежую полную среду.Клетки собирали через 24 часа после трансфекции.
Статистический анализ в основном проводился с использованием t-критерия Стьюдента в программном обеспечении Excel (Microsoft, Вашингтон, округ Колумбия, США).Для экспериментального анализа животных проводили двусторонний дисперсионный анализ с использованием программного обеспечения Prism 3.0 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США). Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-значения <0,05 считались статистически значимыми. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Значения P<0,05 считались статистически значимыми. P < 0,05. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Значения P<0,05 считались статистически значимыми.
Все экспериментальные протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Медицинского факультета Сеульского национального университета (номер IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Ферли Дж. и др.Предполагаемая глобальная заболеваемость и смертность от рака в 2018 году: источники и методы GLOBOCAN.Интерпретация.Дж. Рак 144, 1941–1953 (2019).
Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Понимание факторов риска опухолей головного мозга и их терапевтических вмешательств. Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Понимание факторов риска опухолей головного мозга и их терапевтических вмешательств.Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Обзор факторов риска опухолей головного мозга и основных терапевтических вмешательств. Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Глубокое понимание факторов риска опухолей головного мозга и терапевтических вмешательств.Рашид С., Рехман К. и Акаш М.С. Обзор факторов риска опухолей головного мозга и основных терапевтических вмешательств.Биомедицинская наука.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке органов пищеварения и женских половых путей человека: краткое изложение эпидемиологических и лабораторных данных. Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке органов пищеварения и женских половых путей человека: краткое изложение эпидемиологических и лабораторных данных.Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и женских половых путей: сводка эпидемиологических и лабораторных данных. Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж.据总结。 Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактерио-вирусное взаимодействие в пищеварении в ротовой полости человека и женских репродуктивных путях: краткое изложение популярных научных исследований о заболеваниях и лабораторных данных.Като И., Чжан Дж. и Сунь Дж. Бактериально-вирусные взаимодействия при раке желудочно-кишечного тракта человека и раке женских половых органов: сводка эпидемиологических и лабораторных данных.Рак 14, 425 (2022).
Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углерод и липидный обмен клеток-хозяев. Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углерод и липидный обмен клеток-хозяев.Махон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. Огненная инфекция приводит к раку: как опухолевые вирусы на основе ДНК изменяют центральный углерод и липидный обмен клеток-хозяев. Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. Магон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. От инфекции к раку: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углерод и липидный обмен клеток-хозяев.Махон, К.Л. и Пэриш, Дж.Л. Перевоплощает инфекцию в рак: как ДНК-опухолевые вирусы изменяют центральный углеродный и липидный обмен в клетках-хозяевах.Открытая биология.11, 210004 (2021).
Коррейя да Коста, Ж.М. и др.Катехолэстрогены шистосом и печеночных сосальщиков и гельминтоассоциированного рака.передний.жарко внутри.5, 444 (2014).